细菌小RNA是长度为50-500nt,一般不含有开放阅读框(ORF),因此不编码蛋白,但是却有独立的功能的RNA分子。小RNA广泛存在于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中；它们在细菌的碳代谢、细胞运动、群体感应、致病以及对环境胁迫的应答等许多不同的生理过程发挥着非常重要的调控作用。众所周知,细菌对环境具有极强的适应性,而最近的研究发现,小RNA在细菌应对环境胁迫的适应中发挥了非常重要的作用。在众多的环境胁迫中,重金属胁迫(重金属离子过量或缺乏)是细菌在自然生存条件下经常遇到的环境胁迫之一。已有证据证明,小RNA在调控细菌的铁离子代谢中起关键作用。但是,小RNA在包括锌离子在内的其它重金属代谢中的作用还不十分清楚。十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc)是引起甘蓝、萝卜、白菜、油菜等十字花科农作物黑腐病的病原菌,同时也是研究病原细菌致病分子机理的模式菌之一。为了鉴定Xcc中参与对高锌离子浓度的耐受以及对缺锌条件的适应的小RNA,本研究首先采用RNA测序(RNA-seq)技术,鉴定了Xcc中表达受添加ZnSO4和EDTA影响的小RNA,然后对部分表达受添加ZnSO4和EDTA影响的小RNA的生物学功能进行了鉴定。为了在全基因组水平上鉴定Xcc中表达受ZnSO4和EDTA影响的小RNA,本研究分别在丰富培养基NYG以及在添加了EDTA(终浓度为300μM)或ZnSO4(终浓度为350μM)的NYG培养基中培养Xcc8004菌株至对数期,然后收集细胞提取总RNA。去除rRNA后,用变性PAGE胶对总RNA进行电泳分离,然后分别回收总RNA中大小为50-200nt和201-500nt的小分子RNA,最后进行Solexa cDNA库构建和测序。接着,用本实验室之前建立的方法对Solexa测序数据进行分析,找出表达受ZnSO4和EDTA影响的候选小RNA。最后,用Northern杂交或RT-PCR对这些选小RNA进行验证。Solexa测序数据分析结果显示,以表达丰度差异大于或等于5倍为筛选条件,表达受ZnSO4影响的有222个(诱导81个,抑制145个),受EDTA影响的候选小RNA有540个(诱导334个,抑制206个),表达同时受EDTA和ZnSO4影响的有108个(同时受诱导47个,同时受抑制61个)。本研究随机选了17个表达受EDTA或ZnSO4影响的候选小RNA进行Northern杂交或半定量RT-PCR验证,结果与Solexa测序数据基本一致,说明本研究的Solexa测序在小RNA的定性和定量方面均是可靠的。为了确定候选小RNA的转录方向,本研究分别通过Northern杂交或链特异性RT-PCR对部分小RNA的转录方向进行确定,目前,本研究已经确定了11个小RNA的转录方向。为了弄清这些表达受EDTA和ZnSO4影响的小RNA是否在Xcc对重金属胁迫的适应中发挥作用,本研究分别通过缺失和过量表达两种方法对这些小RNA的功能进行研究。目前已经完成了6个小RNA的缺失突变体和过量表达株的构建,并对这些缺失突变体和过量表达株对EDTA的耐受力以及对Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Cd2+和Cf+等重金属离子的耐受力进行了分析。结果显示,这6个表达受ZnSO4和EDTA影响的小RNA的缺失突变体和过量表达株对EDTA的耐受力以及对Zn2+、Ni2+、C02+、Mn2+、Cd2+和Cu2+等重金属离子的耐受力和野生型菌株没有显著差异,说明这些小RNA在Xcc对重金属胁迫的适应中没有或只发挥微弱的作用。此外,本研究还对这6小RNA的缺失突变体和过量表达株的致病力、致病因子产生、细胞运动性等表型进行了检测和分析。结果显示,它们在致病力、致病因子产生、细胞运动性等方面和野生型菌株没有显著差异。说明这些小RNA在这些表型相关的细胞过程中没有作用或只发挥微弱的作用。综上所述,本工作采用RNA测序方法,在Xcc8004中发现了几百个表达受ZnSO4和EDTA影响的候选小RNA,其中17个通过了Northern杂交或半定量RT-PCR验证。尽管目前还没有发现在Xcc对重金属胁迫的适应中起关键作用的小RNA,本研究的结果为研究小RNA在Xcc对重金属胁迫的适应中的作用打下了重要基础。