研究背景线粒体是细胞内ATP和活性氧(ROS)产生的主要场所。越来越多的研究表明,线粒体功能异常与许多年龄相关的神经退行性病变密切相关,例如阿尔茨海默症(Alzheimer’ s disease,AD),帕金森病(Parkinson’ s disease,PD)和亨廷顿病(Huntington’ s,HD)等。AD以细胞外β-淀粉样肽(Aβ)沉积形成的老年斑,tau蛋白高度磷酸化导致的神经元纤维缠结和伴有神经元凋亡为主要病理表现,以认知能力进行性减退和进行性痴呆为临床特征,是老年人痴呆中最常见的类型。AD的发病机制并不明确,但大量研究表明神经炎症反应和氧化应激在AD的病理变化中广泛存在。神经元的炎症反应包括小胶质细胞,星形胶质细胞,巨噬细胞和淋巴细胞的激活,进而导致的细胞因子,趋化因子,神经递质和活性氧ROS等炎性分子的释放。炎症信号通路和线粒体功能异常密切联系,所以对两者内在相互作用的探究是十分有必要的。腺嘌呤核苷酸转位酶1(ANT1)定位于细胞线粒体内膜,占线粒体内膜蛋白总量的大约10%。ANT1的主要功能包括介导线粒体内ATP和线粒体外ADP的交换,调控偶联和质子漏。此外,ANT1还和电压依赖性阴离子通道(VDAC),亲环素D(CyPD)共同形成了线粒体通透性转换孔(mPTP)复合体。因此,ANT1的稳定表达对维持线粒体的正常功能极其重要。线粒体是多种炎症因子作用的靶细胞器,大多数的炎症相关因子都能引起线粒体功能异常。核转录因子-κB(NF-κB)是在炎症反应,肿瘤生成和凋亡过程中起重要作用的转录因子之一。未被激活的NF-κB和IκBα在细胞质内结合并稳定存在,而NF-κB被激活后会入核,参与调控下游靶基因的转录。肿瘤坏死因子α(TNFα)和脂多糖(LPS)是常见的NF-κB信号通路激活剂,大量相关报道也证实它们与线粒体的功能异常密切相关。此前的研究表明,TNFα 以抑制ANT1的蛋白表达水平,但具体的调控机制尚不清楚。因此我们重点探究在胶质细胞和神经元等神经细胞中NF-κB信号通路对ANT1调控及其作用机制和对线粒体相关的病理生理改变的影响。这一课题可以为神经退行性病变的中炎症反应和线粒体功能障碍的发生机理提供新的解释,为相关疾病的预防和治疗提供新的方向。研究目的探究核转录因子-κB(NF-κB)对腺嘌呤核苷酸转位酶1(ANT1)表达的影响,以及其对ANT1的调控机制。研究方法1.N NF-κB对ANT1 inRNA表达量的影响1.1将高表达IKK,NF-κB及空白对照的质粒pIKK,pNF-κB和pcDNA3.1mychis分别转染入HEK293细胞中,TRlzol法提取细胞总RNA,利用反转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和ANT1,TNFα,IκB1α等基因的特异性引物检测其各自的mRNA表达量,β-actin为参照基因。1.2将NF-κB信号通路的特异性抑制剂JSH-23,激动剂H2O2分别加入HEK293细胞中,TRlzol法提取细胞总RNA后反转为cDNA,用半定量PCR技术和ANT1,IκBα等基因的特异性引物检测其各自的mRNA表达量,β-act i n为参照基因。2.NF-κB对ANT1的蛋白表达量的影响2.1将高表达NF-κB的质粒pNF-κB和NF-κB抑制制JSH-23加入HEK293细胞中,提取细胞总蛋白,利用蛋白印迹技术(Western blotting,WB)检测ANT 1和p65的蛋白表达量,β-ac t i n为参照基因。2.2将NF-κB信号通路的激活剂TNFα(10ng/ml)加入人胶质母细胞瘤T98G中,作用0,90,180和360 min 后收集细胞并提取核蛋白,利用凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测 NF-κB 的入核;提取细胞总RNA后采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)法检测ANT1的 mRNA 表达量。2.3将NF-κB信号通路的激活剂TNFα(10ng/m])加入T98G细胞中,作用0,90,180和360min后收集细胞并提取总蛋白，利用WB检测ANT1,IκBα,COX-Ⅳ的蛋白表达量,β-actin为参照基因。2.4将ANT1高表达质粒p3xflag-cmv-ANT1转染入T98G细胞,再将NF-κB信号通路的激活剂TN1α加入T98G细胞中,作用0,90,180和360min后收集细胞并提取总蛋白,利用WB和ant i-flag抗体检测外源性ANT1的蛋白表达量,β-actin为参照基因。3.NF-κB对ANT1的转录调控3.1采用机算机Jaspar软件(Jaspar 2016)预测NF-κB在ANT1启动子上可能的结合位点(NF-κB responsive elements,NREs)。3.2 ANT1启动子截短突变体的构建和活性检测:结合预测的结合位点,利用PCR技术从细菌人工染色体中得到人的ANT1基因的启动子序列,采用分子克隆技术插入到无启动子活性的PGL3-BASIC载体中,构成pANT1-lucs。将pNF-κB和截短体质粒共转染HEK293细胞中,利用双荧光素酶报告系统(Dual-luciferase,assay)检测ANT1启动子的活性。3.3 采用染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)检测 NF-κB在ANT1启动子上的NREs。3.4采用EMSA技术进一步确认NF-κB在ANT1启动子上的NREs。4.统计分析应用SPSS软件进行数据统计,采用t检验和one-way ANOVA检验对实验数据进行差异性分析;P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.NF-κB可以降低ANT1 mRNA的表达。1.1外源高表达的NF-κB和IKK可以降低内源性的ANT1的mRNA的表达。同时检测到作为NF-κB信号通路的下游靶基因的TNFoc,IκBα的表达增加,因此提示NF-κB信号通路的激活可以抑制ANT1的转录。1.2激活和抑制NF-κB信号通路后,内源性ANT1的mRNA表达也相应的降低和增加,因此证A实ANT1是NF-κB信号通路的下游靶基因之一。2.NF-κB可以降低ANT1蛋白的表达。2.1同mRNA的表达变化相一致,外源高表达的NF-κB可以降低内源性ANT1的蛋白表达水平,而NF-κB抑制剂可以增加内源性ANT1的蛋白表达水平。2.2 TFα可以激活内源的NF-κB信号通路,并且在作用90min时NF-κB入核增加,且此时ANT1的mRNA和蛋白水平也相应降低。2.3 TNFα对外源性的ANT1的蛋白表达没有影响,因此更加说明NF-κB信号通路是通过抑制ANT1的转录引起ANT1的mRNA和蛋白水平的降低。3.ANT1基因启动子上NF-κB结合位点NREs为+1～+20bp和+41～+61bp。3.1 Luciferase结果显示NF-κB可以降低ANT1启动子截短突变体ANT 1-LUCs的活性,且将可能的NRE范围缩减至ANT1启动子的+1～+61bp。ChlP结果也证实NNF-κB可以结合在ANT1的该启动子范围上。3.2采用Jaspar预测软件预测ChlP验证的-74～+108bp的结合范围,结果提示可能的 NREs 在+2～+14bp,+20～+32bp 和+49～+61bp。3.3 EMSA实验进一步证实ANT1启动子的NREs为+1～+20bp和+41～+61bp。结论1.NF-κB可以降低ANT1基因的mRNA和蛋白水平。2.ANT1的转录受NF-κB的调控,是NF-κB信号通路的下游靶基因。3.ANT1启动子上NF-κB的结合位点位于+ 1～+20bp和+41～+61bp。研究目的探究NF-κB信号通路的激活剂肿瘤坏死因子α(TNFα)对线粒体功能的影响。研究方法1.细胞转染1.1人胶质母细胞瘤T98G细胞的转染:采用Lipofectamine 2000将ANT1基因的敲低质粒pSiANT1和其空白对照质粒pSiCON转染进T98G细胞里,72h后收集细胞,采用WB检测内源性ANT1的敲低程度,β-actin为参照基因。1.2胎鼠神经元的提取:取大鼠胚胎17-18天的胎鼠,断头取脑,分离硬软脑膜,分离大脑皮层神经元,利用木瓜蛋白酶消化成单细胞悬液后计数,贴壁培养5-7天后使用。1.3胎鼠神经元的转染:分别包装含有SiANT1表达载体的慢病毒LV-SiANT1和其对照LV-SiCON,将其分别感染17-18天的胎鼠神经元,72h后收集细胞,采用WB检测内源性ANT1的敲低程度,β-actin为参照基因。2.细胞凋亡将 TNFα(10ng/ml)加入 T98G 细胞,作用 0,90,180 和 360 min 后收集细胞并提取总蛋白,采用WB检测cleaved-caspase3,total-caspase3的蛋白表达水平,β-actin为参照基因。3.T98G细胞内ANT1介导的ATP-ADP交换率将TNFα作用于T98G细胞3h,ANT1高表达质粒pANT1和ANT1敲低质粒pSiANT1转染入T98G细胞48h后加入Digitonin进行细胞通透。此后加入ADP(2mM)和 Magnesium Green K+ salt(1μM),利用酶标仪在505nm(Ex)/535nm(Em)波长测定荧光量,转化为ATP量后计算出ATP-ADP交换率。4.T98G细胞和胎鼠神经元内ATP量的测定将pSiANT1和pSiCON转染入T98G细胞,慢病毒LV-SiANT1和LV-SiCON感染胎鼠神经元,72h后收集细胞,利用GloMax20/20化学发光检测仪和ATP检测试剂盒检测细胞内的ATP量。5.T98G细胞和胎鼠神经元内线粒体mPTP孔开放的测定将Calein-AM(2μM)加入T98G细胞和胎鼠神经元中37℃作用30 min,PBS冲洗后加入CoCl2(1mM)处理30min,PBS冲洗后取一半细胞加入CaCl2(500μM),ionomycin(5μM)和 CATR(1μM)或者 BKA(5μM)处理 30 mi n,使用酶标仪在494nm(Ex)/517(Em)波长下检测荧光量。与初始荧光量相比降低的荧光量代表了 mPTP孔开放程度。6.T98G细胞内Ca2+介导的线粒体肿胀将TNFα作用于T98G细胞3h,ANT1敲低质粒pSiANT1转染入T98G细胞48h 后,提収T98细胞的线粒体,用肿胀缓冲液重悬线粒体后加入CaCl2(100μM),用酶标仪在540nm吸光度处连续检测600s,降低的曲线即代表了线粒体肿胀的程度。7.T98G细胞和胎鼠神经元内线粒体膜电位(Δψm)的检测将TNFα作用于T98G细胞3h,ANT1敲低质粒pSiANT1转染入T98G细胞72h,ANT1敲低慢病毒LV-SiANT1感染胎鼠神经元72h后,加入TMRM(50nM)37℃作用90min,使用荧光显微镜检测细胞TMRM荧光值。8.T98G细胞和胎鼠神经元内活性氧(ROS)的检测将TNFα作用于T98G细胞3h,ANT1敲低质粒pSiANT1转染入T98G细胞72h,ANT1敲低慢病毒LV-SiANT1感染胎鼠神经元72h后,加入DCFH-DA(5μM)37℃作用20min,PBS冲洗后收集细胞,用流式细胞仪检测荧光值;加入DHE(5μM)37℃作用30min,PBS冲洗后收集细胞,用流式细胞仪检测荧光值。研究结果1.WB结果显示,pSiANT 1和LV-SiANT 1都可以使T98G细胞和胎鼠神经元内源性ANT1的蛋白表达降低到50%以下。2.WB 显示,加入 TNFα后 T98G 在 0,90,180,360min 内 cleaved-caspase3的量无明显变化,提示此时TNFα不影响细胞的凋亡。3.ATP-ADP交换率实验显示,T98G细胞内高表达ANT1后ATP-ADP交换率较对照升高;而敲低ANT1的T98G的交换率较对照组降低;加入TNFα后ATP-ADP交换率也相应降低,提示TNFα可以通过降低ANT1的表达降低ATP-ADP交换率。4.与对照组相比,加入TNFα和敲低ANT 1后,T98G细胞内的ATP量降低;加入TNFα和敲低ANT1的胎鼠神经元内ATP含量也降低,提示TNFα可以通过降低ANT1的表达降低细胞内ATP的量。5.线粒体mPTP孔开放的检测结果表示,在T98G细胞和胎鼠神经元中,敲低ANT1和加入TNFα后mPTP孔的开放程度均较对照组降低,提示TNFα可以通过降低ANT1的表达降低mPTP孔的开放。6.Ca2+介导的线粒体肿胀实验结果显示,在T98G细胞里,加入TNFα和敲低ANT1的表达后,线粒体的肿胀程度较对照组降低,结果提示TNFα可以通过降低ANT1的表达降低线粒体的肿胀程度。7.线粒体膜电位检测结果显示,与对照组相比,在T98G细胞和胎鼠神经元中,敲低ANT1和加入TNFα后线粒体的膜电位都相应增加,因此提示TNFα可以通过降低ANT1的表达增加细胞线粒体的膜电位。8.检测细胞内活性氧的流式结果显示,在T98G细胞和胎鼠神经元中,敲低ANT1和加入TNFα后细胞内活性氧的量都较对照组有所升高,提示TNFα可以通过降低ANT1的表达增加细胞内活性氧的量。9.统计分析应用SPSS软件进行数据统计,采用t检验和one-way ANOVA检验对实验数据进行差异性分析;P<0.05为差异有统计学意义。结论1.NF-κB信号通路的激活可以降低线粒体ATP-ADP交换率。2.NF-κB信号通路的激活可以降低细胞内ATP的量。3.NF-κB信号通路的激活可以降低线粒体mPTP孔的开放。4.NF-κB信号通路的激活可以降低Ca2+介导的线粒体肿胀程度。5.NF-κB信号通路的激活可以增加细胞线粒体的膜电位。6.NF-κB信号通路的激活可以增加细胞内活性氧的量。