论文部分内容阅读
目的:观察饮用水有机污染物对人正常肝细胞系L02细胞株的细胞毒性,并从细胞增殖、炎性因子及其调控的角度,探讨 CD95信号介导核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)分子途径活化在肝细胞损伤中的作用,为饮用水有机污染物致肝细胞毒性机制的完善及阐明提供科学依据。 方法:利用固相萃取法提取饮用水中有机污染物。体外培养 L02细胞,将其分别暴露于培养液(空白对照组)、0.1%二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide,DMSO)(溶剂对照组)和0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000 L/ml饮用水有机提取物(染毒组)中24h、48h、72h。倒置显微镜观察细胞形态,采用MTT法观察L02细胞的增殖情况,使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养液上清中白细胞介素6(interleukin,IL-6)、白细胞介素8(interleukin,IL-8)、白细胞介素10(interleukin,IL-10)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的蛋白含量;细胞上清液中谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)和谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)的活力采用全自动生化分析仪进行检测;应用实时荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、CD95和CD95L基因 mRNA表达水平;免疫印迹(Western blot)方法观察CD95、CD95L蛋白表达水平和NF-κB信号通路的激活情况。 结果:(1)饮用水有机提取物对L02细胞形态学的影响:随着有机提取物浓度的增加及时间的延长,细胞缩小变圆,间隙变大,贴壁细胞明显减少,悬浮的死亡细胞逐渐增加。(2)对L02细胞增殖的影响:随染毒剂量的增加,细胞增殖水平逐渐降低,各染毒组的细胞增殖均明显低于溶剂对照组(P<0.05)。且随染毒时间的延长,细胞增殖水平呈降低趋势,与24h比较,48及72h增殖水平的降低具有统计学意义(P<0.05)。(3)对CD95及其配体表达水平的影响:CD95基因mRNA表达水平在24h的5.0000L/ml组、48h的1.2500L/ml组和72h的0.6250L/ml组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);其蛋白表达水平亦呈升高趋势,在48h的1.2500L/ml组以及72h的0.3125L/ml组明显升高(P<0.05)。而CD95L基因mRNA表达水平在48h的2.5000L/ml组和72h的1.2500L/ml组明显升高(P<0.05),其蛋白表达水平在24h的5.0000L/ml组、48h的2.5000L/ml组和72h的0.6250L/ml组升高明显(P<0.05)。(4)对NF-kB信号通路相关基因的影响:随着有机提取物染毒浓度的增加,IκB蛋白表达水平逐渐降低,在24h、48h和72h时点,次低剂量组(0.6250L/ml)蛋白表达水平均明显低于溶剂对照组(P<0.05)。p65蛋白表达水平则逐渐升高,在24 h和48 h时点,较低剂量组(1.2500 L/ml)蛋白表达水平明显升高(P<0.05);而在72 h时点,次低剂量组(0.6250L/ml)即升高明显(P<0.05)。(5)饮用水有机提取物致炎性因子表达的改变:IL-6基因mRNA表达水平在染毒24h的1.2500L/ml组,48h和72h的0.6250L/ml组均明显升高(P<0.05);其蛋白水平在各染毒组均呈升高明显(P<0.05)。IL-8基因 mRNA表达水平在24h的2.5000L/ml组、48h的1.2500L/ml组和72h的0.6250L/ml组均明显升高(P<0.05);各染毒组的IL-8蛋白水平均呈升高趋势,除24h和48h的0.3125L/ml组外,其余组的升高有统计学意义(P<0.05)。IL-10基因mRNA表达水平逐渐升高,除24h的0.3125L/ml和0.6250L/ml组外,其余组的升高均有统计学意义(P<0.05);各染毒组 IL-10蛋白水平均明显高于溶剂对照组(P<0.05)。TNF-α基因 mRNA表达水平在染毒24h的1.2500L/ml组、48h的0.6250L/ml组和72h的0.3125L/ml组明显升高(P<0.05);其蛋白水平在24h的1.2500L/ml组、48h和72h的0.6250L/ml组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(6)对L02细胞相关损伤指标的影响:有机提取物处理 L02细胞后,在24h时点,AST及ALT水平在1.2500L/ml以上处理组明显升高(P<0.05);而在48h和72h时点,所有处理组的AST及ALT水平均明显高于对照组(P<0.05)。(7)相关性分析:IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平与IκB蛋白表达水平均呈负相关关系(r=-0.9450、-0.8510、-0.8640、-0.8180,P<0.05);而与p65蛋白表达水平均呈正相关关系(r=0.9220、0.8160、0.8280、0.8650,P<0.05)。ALT水平与IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α蛋白表达水平均呈正相关关系(r=0.8420、0.7500、0.8680、0.8320,P<0.05);而AST水平与上述指标亦呈正相关关系(r=0.8490、0.7950、0.9320、0.8760,P<0.05)。 结论:(1)饮用水有机污染物可诱导L02细胞形态改变、抑制细胞增殖、导致细胞损伤,并呈剂量-效应关系(2)饮用水有机污染物可活化 CD95及其配体 CD95L,通过 IKK激酶激活NF-κB信号分子途径,从而调控下游炎症因子的转录表达。(3)炎性因子的异常分泌、炎症反应的产生是饮用水有机污染物致肝细胞损伤的重要分子机制。