肝纤维化是慢性肝脏疾病最重要的病理特征,肝脏内细胞外基质（ECM）的合成大于降解,致使ECM在肝脏内过度沉积所致的病理过程,它是一种可逆性病变。阻抑、逆转肝纤维化进程成为非常重要的治疗对策。肝星状细胞（HSC）的活化是肝纤维化的最终共同途径,是肝纤维化发生、发展的中心环节,故越来越多的抗肝纤维化药物研究选择HSC作为治疗的靶标。近几年来中医药抗肝纤维化治疗研究取得较大进展。复方六月青（CLYQ）对小鼠急性化学性肝损伤有明显的保护作用,CLYQ对鸭乙型肝炎病毒DNA具有抑制作用,CLYQ可有效地抑制HepG2.2.15细胞HBVDNA的复制。本实验采用四氯化碳（CCl₄）诱导的大鼠肝纤维化动物模型和HSC-T6细胞模型,探讨CLYQ抗肝纤维化作用及其分子机制,为开发广西特色民族药材抗肝纤维化提供理论和实验依据。第一部分体内实验复方六月青抗大鼠肝纤维化作用及其机制的研究目的:复方六月青对CCl₄诱导大鼠肝纤维化的影响。方法:SD雄性大鼠随机分为2组:正常对照组及肝纤维化模型组。肝纤维化模型组100只,背部皮下注射CCl₄造模,剂量40%CCl₄花生油0.3 ml/100g,每周2次。正常对照组10只,采用生理盐水背部皮下注射,剂量同40%CCl₄花生油溶液,每周2次。分别于造模后第4周、第5周及第6周抽?只肝纤维化大鼠及1只正常对照组大鼠,进行病理学检查,监测肝纤维化形成的情况。将病理检查确认肝纤维化形成SD大鼠60只,随机分为5组。①正常对照组:等量的生理盐水;②模型对照组:等量的生理盐水;③阳性对照组:秋水仙碱（colchicine）,0.2 mg/kg/d;④复方六月青高剂量组:30 g/kg/d;⑤复方六月青中剂量组:15 g/kg/d;⑥复方六月青低剂量组:7.5 g/kg/d。均以每日1次空腹灌胃连续给药4周。末次给药24小时后,戊巴比妥钠麻醉,打开腹腔,腹主动脉采血,分离血清,于-20℃保存备用。迅速称取约50-100 mg肝组织放入液氮中迅速冷冻后,转移放置于-80℃超低温冰箱保存,用于抽提肝组织总RNA。于肝左叶同一部位取肝组织约1×1×1 cm³大小,固定于10%中性福尔马林溶液,做光镜观察和免疫组化用;另一部分约1×1×1 cm³大小,固定于2.5%戊二醛作电镜观察用。采用酶联免疫吸附实验（ELISA）法等方法检测血清学指标超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、羟脯氨酸（Hyp）、透明质酸（HA）和金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）。采用HE染色光镜下观察肝组织纤维化程度,透射电子显微镜下观察肝细胞超微结构改变,免疫组织化学法检测肝组织Ⅰ型胶原（ColⅠ）蛋白表达,运用实时荧光定量PCR方法对肝组织ColⅠmRNA表达进行相对定量。结果:（1）CLYQ对肝纤维化大鼠血清学指标的影响与正常对照组相比较,模型对照组大鼠血清SOD活力显著降低（P<0.01）,而MDA、Hyp、HA和TIMP-1含量明显升高（P<0.01）,说明造模方法正确,造模成功。与模型对照组相比较,CLYQ各剂量组均可显著升高肝纤维化大鼠血清SOD活力（P<0.01）,CLYQ各剂量组均可显著降低肝纤维化大鼠血清MDA、Hyp、HA和TIMP-1含量（P<0.01）,且随着药物浓度的增加,其作用逐渐增强,呈现量效反应关系。（2）CLYQ对肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响HE染色病理结果显示,正常对照组大鼠肝脏结构完整。模型对照组大鼠肝脏正常肝小叶结构被破坏,由大小不等的圆形或椭圆形肝细胞结节所构成的假小叶取代,结节周围纤维组织增生,少量炎细胞浸润。CLYQ高、中剂量组大鼠肝脏肝小叶结构完整,汇管区有少量纤维组织增生。CLYQ低剂量组肝细胞排列紊乱,肝小叶结构有破坏,尚完整,结节周围纤维组织增生,少量炎细胞浸润。电镜结果显示,正常对照组大鼠肝细胞形态清晰,模型对照组大鼠肝细胞周边胶原纤维增生明显,CLYO作用后的大鼠肝纤维化组织可见较多正常,形态良好,少量肝细胞凋亡小体。（3）CLYQ对肝纤维化大鼠肝组织ColⅠ蛋白表达的影响免疫组化结果显示,ColⅠ蛋白在正常大鼠肝组织呈低水平表达,肝细胞浆内没有表达。模型对照组大鼠肝组织ColⅠ蛋白表达广泛,呈弥漫性,细胞浆可见有表达,免疫组化染色呈强阳性。CLYQ作用后的大鼠肝纤维化组织ColⅠ蛋白表达面积和强度显著减少和减弱（P<0.05,P<0.01）,细胞浆内表达呈明显的剂量依赖性降低。（4）CLYQ对肝纤维化大鼠肝组织ColⅠmRNA表达的影响实时荧光定量PCR结果提示,与模型对照组相比较,CLYQ各浓度组均可显著下调ColⅠmRNA的表达（P<0.01）,且表现一定的剂量依赖性。结论:1.CLYQ可增强肝纤维化大鼠血清SOD活力,降低MDA的含量,提示其具有抑制脂质过氧化作用,其机制可能与其抗自由基,抑制脂质过氧化有一定关系。2.CLYQ可抑制肝纤维化大鼠肝组织中成纤维细胞及胶原纤维增生,抑制肝纤维化大鼠血清Hyp、HA、TIMP-1的分泌,下调肝纤维化大鼠肝组织ColⅠmRNA及蛋白表达,提示其拮抗CCl₄诱发SD大鼠肝损害,抑制胶原合成与沉积,从而抑制ECM的沉积,具有抗肝纤维化的综合优势。第二部分体外实验复方六月青对肝星状细胞的影响目的:研究复方六月青对HSC增殖、凋亡和抑制纤维合成的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法:用HSC-T6细胞作为体外模型,将CLYQ药物原液倍比稀释成5个浓度进行实验,每个浓度设6个复孔,置CO₂孵箱（37℃,5%CO₂）中培养。采用四甲基噻唑蓝（MTT）法检测CLYQ对细胞的毒性,计算半数细胞毒浓度(TC₅₀)和最大无毒浓度（TC₀）,评价CLYQ对HSC增殖的抑制作用。选择HSC-T6细胞存活率在90%以上的药物浓度作为实验所用浓度,分别为CLYQ 3.6 mg/ml,1.8 mg/ml,0.9 mg/ml三个浓度组。以等量的完全培养液为空白对照组,以colchicine 6.25μg/ml为阳性对照组。各组培养24小时后,分别吸出细胞上清液,-20℃保存备用。采用ELISA法检测HSC-T6细胞上清液Hyp、HA和TIMP-1。0.25%胰酶消化,收集细胞,采用吖啶橙染色、Annex V-FITC和PI双染结合流式细胞术检测CLYQ对HSC-T6细胞凋亡的影响,采用电镜观察CLYQ对HSC-T6细胞超微结构的影响,采用免疫细胞化学法检测CLYQ对HSC-T6细胞ColⅠ蛋白表达的影响,运用实时荧光定量PCR方法检测CLYQ对HSC-T6细胞ColⅠmRNA表达进行相对定量。结果:（1）CLYQ对肝星状细胞增殖及细胞外基质的影响在CLYQ培育后24小时,CLYQ各浓度组对HSC-T6细胞增殖均表现出较强的的抑制作用（P<0.05,P<0.01）,且随着药物浓度的增加,抑制作用有所增强,说明CLYQ对HSC-T6的抑制作用有一定的量效关系。体外实验结果显示,显示TC₅₀=6.191 mg/ml,TC₀=3.504 mg/ml,提示CLYQ对HSC-T6细胞毒性很低,CLYQ对HSC-T6细胞抗增殖作用并不是非特异性细胞毒性作用所致。与空白对照组相比较,CLYQ各浓度组均可显著降低细胞上清液Hyp、HA和TIMP-1含量（P<0.05,P<0.01）,且随着药物浓度的增加,其降低作用逐渐增强,呈现量效反应关系。结果提示,CLYQ在体外对HSC-T6细胞有显著的抗增殖作用。（2）CLYQ对肝星状细胞凋亡的影响吖啶橙染色法检测的结果显示,空白对照组中的HSC-T6细胞绝大部分细胞状态良好,胞质呈红色,胞核呈绿色。CLYQ各浓度组大部分细胞状态良好,随着药物剂量增大,凋亡细胞逐渐增多,胞核呈黄色深染,碎裂,核物质外溢进入胞质。与空白对照组相比较,CLYQ对HSC-T6凋亡细胞比例的影响有统计学差异（P<0.01）,其凋亡率细胞比例有明显的剂量依赖性。流式细胞术检测的结果显示,空白对照组凋亡细胞比例为4.82,CLYQ3.6 mg/ml浓度组凋亡细胞比例为10.1,1.8 mg/ml浓度组凋亡细胞比例为6.67,0.9 mg/ml浓度组凋亡细胞比例为5.18。表明CLYO对HSC-T6有一定的促细胞凋亡作用。电镜结果显示,空白对照组细胞形态清晰,细胞膜、核膜完整,细胞表面有大量微绒毛。CLYQ作用后的HSC-T6可见少量坏死细胞和许多不同程度的凋亡细胞。（3）CLYQ对肝星状细胞ColⅠ蛋白表达的影响免疫细胞化学法检测的结果显示,空白对照组HSC-T6细胞在CLYQ处理前,免疫细胞组化染色呈强阳性,呈黄褐色甚至深褐色分布于胞质。CLYQ各浓度组HSC-T6细胞中ColⅠ蛋白表达显著减弱,阳性部位颜色变为浅黄色,与处理前的灰度值比较有显著性差异（P<0.01）。（4）CLYQ对肝星状细胞ColⅠmRNA表达的影响实时荧光定量PCR结果显示,与空白对照组相比较,CLYQ3.6 mg/ml,1.8 mg/ml浓度组可显著下调HSC-T6细胞中ColⅠmRNA表达（P<0.01）。提示CLYQ的抗肝纤维化作用可能部分是通过抑制ColⅠ基因表达水平而完成的。结论:1.CLYQ可以通过HSC的增殖和诱导HSC凋亡,从而使ECM合成减少,肝纤维化减轻。2.CLYQ可通过下调HSC的ColⅠmRNA及蛋白表达,从而减少ECM合成,可能是其抗肝纤维化分子机制之一。