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目的:基于动物模型探讨补肾活血方骨复生对激素性股骨头坏死大鼠OPG/RANKL/RANK信号通路的影响,以激素性股骨头坏死作为股骨头坏死的代表,剖析中医药防治股骨头坏死的分子机制,为中医药防治股骨头坏死提供一定的理论依据。 方法:取80只雌雄各半2月龄SD大鼠,所有动物随机分为正常组(n=20)、模型组(n=20)、中药组(n=20)、西药组(n=20),除正常组外其余各组连续2d每日经尾静脉注射40μg/kg的脂多糖,之后再连续3d,每日臀部肌肉(所有动物统一从右侧臀大肌以45度角匀速注射)注射地塞米松25mg/kg建立早中期激素性股骨头坏死大鼠模型,为计量准确,每次注射前称量体重,每次注射时间均在9Am至11Am之间。同时每周肌注两次青霉素预防感染,每次5万u/只。正常组饲养7日后经水合氯醛麻醉摄双髋正位X线检查,次日处死取双侧股骨头标本并沿冠状面切开(部分股骨头标本常规脱钙脱水后行组织形态学检查,部分股骨头标本经RNA保存液处理后置于-80°保存),余各组动物于造模6w后取3只经水合氯醛麻醉摄双髋正位X线检查,次日处死取双侧股骨头标本并沿冠状面切开(常规脱钙脱水后行组织形态学检查),模型组剩余动物全部处死取双侧股骨头标本并沿冠状面切开(部分股骨头标本常规脱钙脱水后行组织形态学检查,部分股骨头标本经RNA保存液处理后置于-80°保存)。中药组和西药组于第7w起分别按照相应剂量灌胃,在灌胃6w后将各组动物全部处死取双侧股骨头标本并沿冠状面切开,各给药组一部分股骨头标本常规脱钙脱水后行组织形态学检查,另外一部分股骨头标本取出当天立刻研磨粉碎提取骨组织中的总RNA,同时将正常组、模型组经RNA保存液处理后的股骨头标本一并研磨粉碎提取骨组织中的总RNA。观察各组动物治疗前后的一般情况;肉眼观各组动物离体股骨头的外观形态;摄双髋正位X线观察各组动物在体股骨头的影像学改变;HE染色评价各组炎性细胞浸润情况,滑膜组织增生情况,计算空骨陷窝率;RT-PCR检测骨组织中OPG、RANKL、RANK的基因表达情况,所有实验数据采用SPSS19.0软件进行统计分析与处理。 结果:(1)正常组大鼠变化不明显,饮食、活动及精神、毛色无变化,体质量逐渐增加;模型组大鼠精神差,毛色光泽度轻度晦暗无光泽,多有腹泻表现,体质量明显下降,运动较少;中药组、西药组运动尚可,毛发光泽度较正常组差,体质量轻度下降,偶有腹泻症状,但中药组大鼠一般情况更接近于正常组。(2)实验室取材见中药组及正常组股骨头色泽鲜亮、外形未见明显变化,骨质较坚硬,西药组大部分动物股骨头色泽鲜亮,偶有一侧股骨头颜色稍晦暗,但外形均未见明显变化,骨质较坚硬,模型组股骨头色泽明显变暗,无光泽,骨质较疏松,易于切割及刨削。(3)各组动物行髋关节正位X线检查:正常组、中药组双侧股骨头骨皮质完整,大小及形态正常,骨密度均匀,骨小梁清晰;西药组股骨头头内密度仍有部分不均匀,但骨皮质完整,大小及形态正常,骨密度均匀,骨小梁清晰;模型组股骨头骨质疏松,头内密度不均,可见大小不一的囊状透亮区,部分骨小梁模糊不清,但股骨头保持完整。(4)骨组织病理形态学镜检:中药组可见骨小梁粗大,排列较规则,骨细胞大部分正常,空骨陷窝较少,脂肪细胞未见大量增生,骨髓腔内造血细胞较多,软骨下可见丰富血管;西药组可见骨髓腔内造血细胞较中药组减少,余同中药组,无明显变化;模型组可见骨小梁明显变细,间距增大,结构紊乱,部分有断裂现象,骨髓脂肪细胞增多,髓腔内造血细胞减少,甚至消失,骨细胞萎缩、边集,空骨陷窝数广泛存在;正常组骨小梁骨细胞清晰可见,周围成骨细胞丰富,空骨陷窝少见,骨髓腔内造血细胞丰富,形态正常。(5)各组大鼠骨组织中OPG、RANKL、RANK的基因表达情况:模型组与正常组比较,模型组骨组织中RANKL、RANK的表达均有所上调,而OPG的表达明显下调,两组骨组织中OPG、RANKL、RANK的基因表达有显著差异,差异具有统计学意义(P<0.05);中药组和西药组分别与模型组比较,中药组和西药组骨组织中RANKL、RANK的表达均下调,且中药组骨组织中RANKL、RANK的表达下调更明显,而中药组和西药组骨组织中OPG表达均上调,有显著差异(P<0.05);中药组和西药组与正常组比较,骨组织中OPG、RANKL、RANK的表达差异无统计学意义(P>0.05);中药组与西药组比较,骨组织中OPG的表达有差异(P<0.05),而RANKL、RANK的表达无显著差异(P>0.05)。 结论:(1)两种治疗方法均能改善SD大鼠的一般情况,并抑制骨组织中RANKL、RANK的表达,但补肾活血方骨复生的作用更加明显;(2)补肾活血方骨复生可以明显上调OPG的表达,下调RANKL、RANK的表达,增加骨细胞形成、促进新生血管的形成、促进骨量上升、促进骨代谢、减少骨钙流失、促进骨质成熟,有效改善股骨头局部缺血缺氧环境,从而有效干预激素性股骨头坏死的形成。