2006年,Yamanaka等首次实现了由转录因子介导的体细胞重编程,命名为诱导多能干细胞(iPSCs),自此,细胞重编程技术成为生命科学与再生医学领域的研究热点。通过病毒等载体介导,在体细胞内异位表达与细胞多能性相关的关键因子(如Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等),可以实现体细胞向多能状态的逆转,最终生成表型和分化潜能均类似于胚胎干细胞的iPSCs。由于iPSCs来源于患者自身的体细胞,且具有与胚胎干细胞相当的自我更新能力和向三胚层分化的潜能,将iPSCs作为一种替代胚胎干细胞的种子细胞应用于临床,可避免胚胎干细胞涉及的伦理和法律问题,且iPSCs源于患者自身体细胞,可实现病人的个性化治疗。目前,iPSCs的临床应用还面临许多困难,诸如,传统的病毒转染方法和癌症相关因子(如c-Myc)的应用存在安全隐患,而非病毒方法的重编程效率低下,难以满足临床对于iPSCs安全性和数量的需求等等,因此,研究探索安全、高效的重编程策略具有重要的价值和意义。本文从基于天然多糖的重编程转录因子OCT4纳米传递、重编程因子组合的筛选、基于组织工程三维体系的细胞重编程三个方面,研究探索安全、高效的体细胞重编程新策略。第一章细胞重编程的研究进展对细胞重编程的概念及研究进展进行了阐述；对细胞重编程技术在人类疾病治疗、药物开发以及生物发育等领域的应用和意义进行了探讨；通过大量资料查阅,对细胞重编程的方法进行了综述；阐述了细胞重编程技术的研究现状及其应用于临床实践所面临的问题,提出了本论文的立题依据、设计思路与构想,为本论文实验工作的顺利进行提供了理论依据。第二章基于天然多糖的重编程转录因子OCT4纳米传递研究采用水提醇沉、树脂纯化的工艺提取分离了4种高纯度、分子量分布集中的天然多糖(文中分别以字母A、B、C、D表示)；采用三种阳离子化方法,即精胺(Sp)、乙二胺(Ed)和聚乙烯亚胺(PEI)修饰的方法,分别对所得的每种多糖进行阳离子化修饰；选择与体细胞重编程密切相关的胚胎干细胞转录因子OCT4作为模型基因,通过琼脂糖凝胶电泳筛选出了与质粒OCT4的结合效果最佳的4种阳离子多糖(A-Ed、B-PEI、C-Ed和D-Sp)进行后续基因转染效率评价；透射电镜观察、粒径分析以及Zeta电位测定结果表明：阳离子多糖能有效压缩、包裹大分子质粒OCT4,得到形态规则、表面带正电荷的球形或椭球形的纳米粒；MTT比色法证明了阳离子多糖/OCT4纳米粒具有良好的生物安全性；酶联免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR以及活细胞工作站等技术分别从目的蛋白表达水平、RNA转录水平以及纳米粒入胞过程等方面对阳离子多糖/OCT4纳米粒的基因转染效率进行综合评价,从多方面证明了阳离子多糖是一种理想的细胞重编程载体材料。第三章重编程因子组合的筛选与细胞重编程研究通过对OCT4、SOX2和miR302-367这3个因子进行随机组合,采用阳离子多糖D-Sp作为基因载体,制备了一系列多糖-基因纳米粒；以qRT-PCR考察了细胞转染效率,并通过碱性磷酸酶染色,统计阳性克隆数,筛选出了最佳的因子组合：OCT4、SOX2和miR302-367；选用该组合与阳离子多糖D-Sp制备得到D-Sp/OS-miR纳米粒,对人源体细胞进行重编程研究；经琼脂糖凝胶电泳、透射电镜观察、粒径测定以及电位测量等一系列检测,结果显示：D-Sp/OS-miR纳米粒在质量比为10：1时,粒径最小,且集中分布在70～150 nm的区间内,纳米粒呈形态规整、分散均匀、表面带正电荷的球形或椭球形；qRT-PCR、免疫荧光、Western blot以及HE组织染色等方法证明了D-Sp/OS-miR纳米粒诱导生成的iPSCs能够表达胚胎干细胞多能性标记,并且在体、内外均能够向内、中、外三个胚层进行分化。第四章基于组织工程三维体系的细胞重编程研究首次尝试在三维体系中细胞重编程的可能性。采用直接冻干、不添加任何交联剂的方法制备了胶原支架,并对支架进行了形态、孔隙率和吸水率等表征；以阳离子多糖D-Sp、磷酸钙以及编码Yamanaka因子的4种质粒为原料,采用反相微乳法制备了多糖-磷酸钙混杂纳米粒,通过形态观察、粒径测定、Zeta电位测量以及琼脂糖凝胶电泳等实验对纳米粒的性质进行了表征；将多糖-磷酸钙混杂纳米粒吸附到空白胶原支架内表面,得到三维载基因纳米粒-胶原支架；扫描电镜下观察到三维载基因纳米粒-胶原支架内部疏松多孔的微观结构,孔径适宜、相互连通的支架孔道有效模拟了细胞在体内生长的三维微环境；将人脐带间充质干细胞接种于三维载基因纳米粒-胶原支架进行重编程,随着培养时间的延长,细胞在支架中形成了边界清晰、形态规整的球形或椭球形的iPSC细胞球；RT-PCR检测结果显示：在三维载基因纳米粒-胶原支架中,每一个重编程转录因子的表达量都显著高于二维体系(*,P<0.05),且持续时间延长；HE染色、免疫组化、免疫荧光、染色体核型分析以及启动子甲基化测定等实验从形态、蛋白水平以及基因水平等多方面证明了iPSCs细胞球的多能性；在三维支架中诱导生成的细胞球能够在二维滋养层细胞上持续、稳定地传代至20代以上,并建立稳定的细胞系；体内畸胎瘤实验最终证明：三维载基因纳米粒-胶原支架能够成功诱导iPSCs的生成。结论本论文成功筛选出基于天然多糖的非病毒纳米基因载体,并应用于重编程转录因子OCT4纳米传递,通过对纳米粒的表征和基因转染效率的考察,证明了阳离子多糖作为重编程基因载体的巨大潜能；以安全性良好的microRNA替代癌症相关基因C-MYC和KLF4,形成一个全新的非致癌三因子组合,OCT4+SOX2+miR302-367,然后以筛选出的阳离子多糖为基因载体,成功诱导人iPSCs生成；首次构建了基于组织工程三维支架的体细胞重编程体系,实验证明：与二维环境相比,三维体系中的细胞重编程转录因子表达水平高且持续时间长,重编程速度快、效率高,而且只需一步转染,诱导生成的iPSCs够在二维滋养层细胞上持续、稳定地扩增,为后续iPSCs的临床应用奠定基础。