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目前，中国利用中药进行乙醇降解的研究日益增多，但利用罗汉果内生菌进行乙醇降解的研究较少。因此，本研究通过传统培养分离法从罗汉果中分离内生菌，采用测定乙醇耐受性的平板法和重铬酸钾-硫酸法从中筛选具有乙醇降解能力的菌株，通过形态观察及分子生物学手段对其进行鉴定，以乙醇降解率为考察指标，通过单因素实验及正交实验对其发酵条件进行优化。通过研究快速乙醇降解能力以及耐胃肠液实验来判断其是否具有活菌制剂的潜力，以期为具有乙醇降解功能产品的研发提供新途径，为工业生产产品奠定基础。
主要完成的研究内容如下：
（1）罗汉果内生菌株的分离
从根、茎、叶和果实等组织中分离得到内生菌株共68株，其中从根部分离得到27株，茎部15株，叶片5株，果实21株。
（2）乙醇降解菌株的筛选
在实验的68株菌株中，17株对乙醇具有耐受作用，依据内生菌株在平板上的生长情况从中挑选14株进行发酵复筛，最终从根部纯化得到的编号为G-1菌株表现良好。菌株G-1发酵液原液对浓度为8%（v/v）的乙醇（复配在PDB培养基中，下同，省略）作用1h时，乙醇降解率为（9.1±0.7）%；对浓度为10%（v/v）的乙醇作用24h时，乙醇降解率为（16.7±0.3）%；对浓度为20%（v/v）的乙醇作用24h时，乙醇降解率为（13.2±1.2）%。因此，选取菌株G-1进行菌株鉴定及后续研究。
（3）菌株G-1发酵液乙醇降解发酵条件优化与菌株鉴定
通过单因素实验与正交实验探究各因素对菌株发酵液乙醇降解率的影响，其结果显示菌株G-1的最佳发酵条件为接种量7%、装液量200/500mL三角瓶、发酵温度32℃、发酵时间3d，菌株G-1发酵液对浓度为20%（v/v）的乙醇作用24h时乙醇降解率为（29.8±0.7）%，是相同条件下，优化发酵条件前菌株复筛时（13.2±1.2）%的2.2倍。
菌株形态学观察：菌落表面突起，菌落高3～5mm，呈絮状，菌丝呈白色，较为质密；背面为粉白色，略带有紫色；在显微镜下观察，分生孢子着生于菌丝上，在顶端聚成卵形。
分子生物学鉴定：其序列长度为534bp，与镰刀菌属（Fusarium）同源性大于99%。综合以上结果得出，菌株G-1为镰刀菌属菌株。
（4）菌株G-1发酵液对乙醇快速降解能力测定及耐肠胃液分析
通过对菌株发酵液的快速乙醇降解能力研究发现，在60min内随着时间的增加，菌株G-1发酵液对三个乙醇浓度的降解率均有上升。说明菌株G-1发酵液具有对乙醇快速降解的特性，能在较短时间内对乙醇进行有效降解。
模拟胃液环境研究结果显示，组间菌株G-1发酵液对浓度为20%（v/v）的乙醇降解率随pH值的降低而降低。与空白对照组相比，菌株G-1发酵液在低酸（pH值=3.0～4.0）的环境下，2h范围内能保持一定的乙醇降解的作用，作用1h时发酵液乙醇降解率相当于空白对照组的72.5%～85.0%，2h时发酵液乙醇降解率相当于空白对照组的52.6%～65.5%。
模拟肠液环境研究结果显示，3个胆盐实验组组内具有相同的趋势，对浓度为20%（v/v）的乙醇降解率均随时间延长而下降，说明随着时间的延长胆盐会影响发酵液的乙醇降解作用。与空白对照组相比，在4h范围内仍具有较好乙醇降解的作用，作用1h时发酵液乙醇降解率乙醇降解率相当于空白对照组的69.3%～75.9%，作用4h时发酵液乙醇降解率相当于空白对照组的57.5%～67.5%。
综合以上实验结果得出菌株G-1发酵液在模拟人体内环境条件下能够保持一定的乙醇降解能力，具有成为活菌制剂的潜力。
（5）乙醇降解活性部位的筛选及其化学成分预实验
结果显示，在各相样品浓度为1mg/mL时，正丁醇相活性最高，对对浓度为20%（v/v）的乙醇的降解率为13.5%。经过化学成分预实验测得该相含有蛋白质、多糖以及黄酮等。
（6）活性部位的纯化及活性成分的初步鉴定
采用大孔吸附树脂D101柱层析法对正丁醇相进行初步分离，结果显示，采用乙醇浓度10%为洗脱剂时洗脱下来的样品其乙醇降解率最高，达到（17.6±0.5）%。采用硅胶柱层析法对该样品进一步纯化，结果显示收集的第4组洗脱液乙醇降解率最优，为（18.1±0.6）%。采用HPLC对第4组洗脱液进行分析，结果显示在2min时出现单峰，通过对其进行化学成分预实验，初步认定其为黄酮类化合物。
本研究从罗汉果内生菌株中筛选到一株具有乙醇降解能力的菌株G-1（镰刀菌属），在模拟人体内环境条件下能够保持一定的乙醇降解能力，初步认定起作用的为黄酮类化合物。
主要完成的研究内容如下：
（1）罗汉果内生菌株的分离
从根、茎、叶和果实等组织中分离得到内生菌株共68株，其中从根部分离得到27株，茎部15株，叶片5株，果实21株。
（2）乙醇降解菌株的筛选
在实验的68株菌株中，17株对乙醇具有耐受作用，依据内生菌株在平板上的生长情况从中挑选14株进行发酵复筛，最终从根部纯化得到的编号为G-1菌株表现良好。菌株G-1发酵液原液对浓度为8%（v/v）的乙醇（复配在PDB培养基中，下同，省略）作用1h时，乙醇降解率为（9.1±0.7）%；对浓度为10%（v/v）的乙醇作用24h时，乙醇降解率为（16.7±0.3）%；对浓度为20%（v/v）的乙醇作用24h时，乙醇降解率为（13.2±1.2）%。因此，选取菌株G-1进行菌株鉴定及后续研究。
（3）菌株G-1发酵液乙醇降解发酵条件优化与菌株鉴定
通过单因素实验与正交实验探究各因素对菌株发酵液乙醇降解率的影响，其结果显示菌株G-1的最佳发酵条件为接种量7%、装液量200/500mL三角瓶、发酵温度32℃、发酵时间3d，菌株G-1发酵液对浓度为20%（v/v）的乙醇作用24h时乙醇降解率为（29.8±0.7）%，是相同条件下，优化发酵条件前菌株复筛时（13.2±1.2）%的2.2倍。
菌株形态学观察：菌落表面突起，菌落高3～5mm，呈絮状，菌丝呈白色，较为质密；背面为粉白色，略带有紫色；在显微镜下观察，分生孢子着生于菌丝上，在顶端聚成卵形。
分子生物学鉴定：其序列长度为534bp，与镰刀菌属（Fusarium）同源性大于99%。综合以上结果得出，菌株G-1为镰刀菌属菌株。
（4）菌株G-1发酵液对乙醇快速降解能力测定及耐肠胃液分析
通过对菌株发酵液的快速乙醇降解能力研究发现，在60min内随着时间的增加，菌株G-1发酵液对三个乙醇浓度的降解率均有上升。说明菌株G-1发酵液具有对乙醇快速降解的特性，能在较短时间内对乙醇进行有效降解。
模拟胃液环境研究结果显示，组间菌株G-1发酵液对浓度为20%（v/v）的乙醇降解率随pH值的降低而降低。与空白对照组相比，菌株G-1发酵液在低酸（pH值=3.0～4.0）的环境下，2h范围内能保持一定的乙醇降解的作用，作用1h时发酵液乙醇降解率相当于空白对照组的72.5%～85.0%，2h时发酵液乙醇降解率相当于空白对照组的52.6%～65.5%。
模拟肠液环境研究结果显示，3个胆盐实验组组内具有相同的趋势，对浓度为20%（v/v）的乙醇降解率均随时间延长而下降，说明随着时间的延长胆盐会影响发酵液的乙醇降解作用。与空白对照组相比，在4h范围内仍具有较好乙醇降解的作用，作用1h时发酵液乙醇降解率乙醇降解率相当于空白对照组的69.3%～75.9%，作用4h时发酵液乙醇降解率相当于空白对照组的57.5%～67.5%。
综合以上实验结果得出菌株G-1发酵液在模拟人体内环境条件下能够保持一定的乙醇降解能力，具有成为活菌制剂的潜力。
（5）乙醇降解活性部位的筛选及其化学成分预实验
结果显示，在各相样品浓度为1mg/mL时，正丁醇相活性最高，对对浓度为20%（v/v）的乙醇的降解率为13.5%。经过化学成分预实验测得该相含有蛋白质、多糖以及黄酮等。
（6）活性部位的纯化及活性成分的初步鉴定
采用大孔吸附树脂D101柱层析法对正丁醇相进行初步分离，结果显示，采用乙醇浓度10%为洗脱剂时洗脱下来的样品其乙醇降解率最高，达到（17.6±0.5）%。采用硅胶柱层析法对该样品进一步纯化，结果显示收集的第4组洗脱液乙醇降解率最优，为（18.1±0.6）%。采用HPLC对第4组洗脱液进行分析，结果显示在2min时出现单峰，通过对其进行化学成分预实验，初步认定其为黄酮类化合物。
本研究从罗汉果内生菌株中筛选到一株具有乙醇降解能力的菌株G-1（镰刀菌属），在模拟人体内环境条件下能够保持一定的乙醇降解能力，初步认定起作用的为黄酮类化合物。