细胞周期检验点是保证细胞增殖周期精确进行的重要机制。细胞周期检验点的异常(如p53突变)与肿瘤细胞基因组不稳定性增加和细胞恶变密切相关;同时该机制也是影响DNA损伤剂抗肿瘤作用的主要因素。利用肿瘤细胞固有的DNA损伤应答缺陷,针对性的选择周期检验点或DNA修复通路分子为靶点,已成为近年来肿瘤治疗研究热点之一。力达霉素(lidamycin,LDM;原名C-1027)是烯二炔类(enediyne)抗肿瘤抗生素家族成员之一,具有高度的抗肿瘤活性,目前处于Ⅱ期临床试验阶段。作为DNA损伤剂,LDM可以诱导细胞周期阻滞及细胞凋亡,其作用依赖于肿瘤细胞的p53状态。本研究通过靶向干扰p53野生及敲除型结肠癌HCT116细胞中的周期检验点激酶Chk1和/或Chk2,观察LDM的增敏作用,探讨靶向干扰Chk1/Chk2对LDM诱导的周期阻滞及细胞凋亡的影响及其分子机制,进一步阐明LDM对肿瘤细胞周期及细胞凋亡的作用机制,为以细胞周期检验点为靶点的肿瘤治疗方案提供理论依据。一、Chk1/Chk2 RNA干扰质粒的构建及其对HCT116细胞增殖的抑制作用1.靶向干扰Chk1或Chk2的siRNA序列的筛选。RNA干扰技术主要通过外源导入与靶基因mRNA互补的双链RNA,从而在mRNA水平抑制靶基因的蛋白表达。本研究根据siRNA设计原理,分别设计并合成了针对Chk1或Chk2的各3条干扰序列。将siRNA分别转染HCT116细胞,检测细胞内Chk1及Chk2 mRNA水平及蛋白的表达水平,选择干扰效果最好的序列,用以构建shRNA表达质粒。2.单独及联合干扰Chk1与Chk2表达质粒的构建。根据有效抑制Chk1或Chk2表达的siRNA序列,采用pCD-shRNA质粒,分别构建Chk1/Chk2单独及联合干扰质粒pCD-shChk1(Chk1 shRNA)、pCD-shChk2(Chk2 shRNA)及pCD-shChk1/2(Chk1/2 shRNA)。同时构建无同源位点的pCD-mock(mock shRNA)作为shRNA对照。RT-PCR及Western blot检测显示:Chk1 shRNA抑制Chk1表达,而不影响Chk2表达;Chk2 shRNA抑制Chk2表达,而不影响Chk1表达;Chk1/2同时抑制Chk1及Chk2表达。3.生长曲线法检测Chk1 shRNA、Chk2 shRNA及Chk1/2 shRNA对p53野生型及p53敲除型HCT116细胞增殖的影响。结果显示,Chk1 shRNA抑制p53野生型及p53敲除型HCT116细胞增殖速度;mock shRNA和Chk2 shRNA对细胞增殖速度无明显影响;Chk1/2 shRNA作用与Chk1 shRNA相似。说明Chk1对HCT116细胞增殖过程具有重要作用。二、Chk1/Chk2干扰增强LDM对HCT116细胞的增殖抑制作用1.SRB法检测LDM对HCT116细胞的增殖抑制作用的量效关系。不同剂量LDM分别作用48h后,结果显示p53野生型HCT116细胞对LDM较p53敲除型HCT116细胞更为敏感性,IC50值分别为0.7 nM及3.0 nM。2.Chk1干扰可增加LDM对HCT116细胞的增殖抑制作用,该作用对于p53敲除型细胞更为显著。Chk1干扰后,0.5nM LDM对p53野生型及敲除型HCT116细胞抑制率分别为69%和77%,分别较mock对照增加37%和74%。Chk2干扰对LDM无显著增敏作用。Chk1与Chk2联合干扰后,LDM对HCT116细胞的增殖抑制作用与Chk1单独干扰相似,0.5nM抑制率为:p53野生型75%、p53敲除型79%,分别较mock对照增加42%和74%。说明Chk1和p53在LDM杀伤HCT116细胞过程中发挥重要功能,决定了细胞对LDM的敏感性。三、Chk1/Chk2干扰对LDM诱导HCT116细胞周期阻滞的影响1.LDM诱导的HCT116细胞周期阻滞与p53状态有关。0.5nM LDM作用48h后,p53野生型HCT116细胞周期阻滞于G1期和G2/M期,而p53敲除型细胞周期阻滞于G2/M期。2.Chk1/Chk2单独或联合干扰对HCT116细胞周期无明显影响。而Chk1干扰可抑制LDM诱导的G2/M期阻滞作用,同时引起sub- G1期水平相应增加。该作用对于p53敲除型细胞更为显著,Chk1干扰使其G2/M期细胞从63%减少到39%,sub-G1则从6%增加到27%;p53野生型细胞的G2/M期细胞从43%减少到30%,sub-G1则从17%增加到25%。Chk2干扰对LDM导致的周期阻滞无明显影响。Chk1/2联合组与Chk1单独干扰结果相似。以上结果说明Chk1在LDM诱导的G2/M期阻滞中发挥重要作用。3.LDM增加细胞中磷酸化H2AX(γ-H2AX)水平,该作用可被Chk1干扰增强,说明Chk1干扰加重了LDM诱导的细胞DNA损伤。此外,LDM处理细胞中有丝分裂期(M期)标志物p-H3水平降低,证实LDM诱导的G2/M期阻滞实际上是G2期阻滞。而Chk1干扰可抑制LDM对p-H3的影响,说明Chk1干扰后细胞周期突破了LDM诱导的G2期阻滞,进入M期开始新一轮的增殖周期。结果进一步说明Chk1在LDM激活的G2期检验点中发挥关键作用。一旦Chk1被抑制,G2期检验点失去作用,因而LDM引起的DNA损伤得不到有效地修复,损伤细胞被迫进入未成熟增殖周期,从而使本不致命的DNA损伤成为致命的严重损伤,导致细胞死亡。Chk1干扰对γ-H2AX和p-H3的作用在p53敲除型细胞中更为显著,提示p53可能通过G1期检验点等途径避免DNA损伤进一步加重。4.Western blot结果显示,Chk1干扰可改变LDM导致的多种细胞周期调节蛋白变化。LDM诱导Chk1、Cdc25C、Cdc2磷酸化水平升高,该作用可被Chk1干扰逆转,提示LDM诱导的G2/M期阻滞是通过Chk1-Cdc25C-Cdc2通路激活。此外LDM升高p53野生型细胞的p53、p21水平,降低Cdk2水平,提示LDM诱导的G1期阻滞可能与p53-p21-Cdk2通路有关。四、Chk1干扰增加LDM诱导HCT116细胞凋亡1.为进一步研究Chk1干扰对LDM的增敏机制,我们通过Annexin V/PI双染检测细胞凋亡的变化。结果显示,与p53敲除型细胞相比,LDM可诱导p53野生型细胞发生更为显著的细胞凋亡。Chk1干扰可增加LDM诱导的细胞凋亡,该作用在p53敲除型细胞(相对mock对照增加78%)中比p53野生型细胞(相对mock对照增加37%)更为显著。Chk2干扰对LDM的凋亡诱导作用无明显影响。Chk1/2联合干扰增加p53敲除型细胞凋亡率为80%、p53野生型细胞为42%,与Chk1单独干扰结果相似。2.Western blot结果显示,LDM激活HCT116细胞的caspase-3及PARP,该作用同样与细胞p53状态有关。对于p53敲除型细胞来说,LDM对caspase-3与PARP的激活作用显著弱于p53野生型细胞,这与凋亡结果相符。提示本实验条件下,LDM主要通过p53依赖的凋亡途径诱导HCT116细胞发生凋亡。Chk1干扰可明显增加LDM对p53敲除型细胞中caspase-3和PARP的激活,提示Chk1干扰可能通过某种p53非依赖的凋亡调节因子来激活凋亡。最近研究发现Chk1干扰和电离辐射联合作用可激活p53缺失细胞中的caspase-2导致凋亡。本研究发现,LDM对于p53野生型和p53敲除型细胞的caspase-2都没有激活作用。而Chk1干扰可激活p53敲除型细胞中的caspase-2,但对p53野生型细胞的caspase-2无影响。以上结果说明,Chk1干扰可通过激活caspase-2和caspase-3参与的、p53非依赖的凋亡通路,在p53功能缺失状态下增加LDM诱导的细胞凋亡。五、结论本论文首次研究了靶向干扰Chk1对LDM的增敏作用及其p53相关性。Chk1干扰可通过消除LDM引起的G2/M期阻滞、增加DNA损伤,从而诱导细胞进人未成熟的细胞周期、增加LDM所致的细胞凋亡和细胞毒性。该作用对于p53敲除的细胞更为显著,这可能与p53参与的G1期检验点有关。此外,在p53敲除型细胞中,Chk1干扰还可激活p53非依赖的caspase-2和caspase-3介导的凋亡通路,增强LDM在的凋亡诱导作用。本研究结果提示,细胞周期检验点蛋白Chk1可能是LDM联合治疗结肠癌的有效作用靶点之一。