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磁性分离在工业上的应用已有较长的历史,但直到20世纪70年代,具有超顺磁性聚苯乙烯均一微球在重力条件下的成功制备才使这一技术在生物医学领域的应用成为可能。磁性载体通常由无机磁性内核和表面包覆的有机高分子外壳两部分组成,兼具超顺磁性和高分子表面功能多样性特点,在生物分离和生物医学工程应用中具有独特的优势,在细胞分离、免疫检测、蛋白质提纯、固定化酶、核酸分离和靶向给药等领域展现出诱人的应用前景。
但是,目前磁性载体的制备和应用研究主要还局限在实验室分析和医疗诊断规模,要将这一技术发展到制备及实际体系的工业应用规模还面临着许多问题和挑战。例如当前文献中有关微米级磁性载体的研究存在着诸如颗粒尺寸过大、制备工艺繁琐、表面功能基团容量低(常在0.01~0.25mmol/g载体之间)和不能放大生产等不足;而纳米磁性载体有较高的比表面积,但颗粒的磁含量很低,磁性较弱,且在实际使用中易团聚,此外还存在着如何实现实际体系的磁分离过程等问题。针对这些问题,本论文较系统地开展了超顺磁性纳米/微米载体的制备、表面修饰、表征及抗体纯化和固定化酶应用等方面的研究工作。主要取得了以下几个方面的研究结果:
首先,针对现有硅烷化方法直接在Fe3O4纳米颗粒表面进行功能化处理存在的问题,提出了新的硅烷化制备磁性纳米载体方案。即用酸化法在无机Fe3O4纳米颗粒表面包上一层或多层二氧化硅,通过调节硅和铁的比例和重复包覆步骤,可以在一定程度上控制颗粒大小、粒径分布和避免颗粒团聚,在此基础上再对表面包硅的磁性纳米球采用硅烷偶联剂进行功能化处理,制备了不同粒径、分散性好、比饱和磁化强度高(18emu/g)的超顺磁性纳米载体。
从悬浮聚合和乳液聚合反应的临界条件分析入手,在大量实验基础上,提出了一种介于乳液聚合和悬浮聚合中间状态的改良悬浮聚合法。即通过适当地改变聚合反应参数和控制反应条件,制备了大小在数个微米之间(0.5~8μm),粒径分布相对较窄的磁性聚合物球,该微球尺寸大小和粒径分布恰好介于常规乳液聚合(0.1~0.7μm)和悬浮聚合(10~2000μm)所得到的微球之间,所得磁性微球具有高的比饱和磁化强度(¨~15emu/g)并表现出超顺磁性。
其次,通过实验探索,选取了几种既能够保持载体的磁性能,又能在其表面产生高容量活性功能基团的高分子化学反应,对合成的磁性纳米/微米球进行了表面功能化修饰,用傅立叶变换红外光谱(FT-IR)对表面功能基团进行了定性和定量表征;并用功能化后载体螯合金属离子(Cu2+)的容量来说明功能化基团的偶联效率。其中氨基硅烷修饰的磁性SiO2纳米载体的表面氨基含量为0.50~0.60mmol/g载体,其对模型蛋白BSA的负载容量为86.5mgBSA/g载体;磁性聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)功能化后表面羟基的量为0.10~0.26mmol/g载体;磁性聚丙烯酸甲酯(PMA)微球的表面氨基含量达到0.40~0.55mmol/g载体。
在上述基础上,将亲和配基蛋白A共价固定到磁性载体表面,确立了以ProteinA为配基的免疫磁性载体制备方法和合成路线,并用于从实际体系小鼠腹水和SARS病毒N蛋白兔抗血清中提纯单克隆抗体,其纯化效率达到10~24mgIgG2a/g载体,优于目前商品化的磁珠(6~8mgIgG2a/g载体),同时设计并制作了一套用于抗体纯化和蛋白分离的磁分离装置。此外,还将具有较高吸附容量的氨基化磁性PMA载体用于脂肪酶(Candidacylindracealipase)的固定化实验,考察了反应条件对固定化酶活和载体载酶量的影响,确立了最适固定化条件,酶活回收率达到72.4%,载酶量为34mg/g载体,固定化后酶的最适温度为50℃比游离酶提高了约13℃,具有良好的稳定性和重复使用性,重复使用10次后,剩余酶活为固定化后初始酶活的55.4%。
最后,结合上述实验结论和实验室已有基础,提出了磁性载体规模化制备工艺和技术路线,设计了相应的生产装置和设备,并进行了中试实验,使上述磁性载体具有可规模化生产效应和实际操作性,初步奠定了产品市场开发的可行性基础。