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实验背景:心肌梗死是充血性心力衰竭的重要原因之一。近年来,尽管药物治疗和介入治疗得到了快速发展,使缺血性心肌病患者的预后有了明显的改善,但药物治疗和介入治疗不能修复坏死的心肌。骨髓间充质干细胞移植疗法可促进梗死局部血管新生和心肌再生而改善心肌梗死后心功能,已初步进入了临床应用,也成为了目前心血管领域的研究热点。基础研究已经表明在心肌梗死后移植MSC,在局部心肌微环境的作用下,MSC可分化为心肌细胞,平滑肌细胞和内皮细胞,促进新生血管的形成,改善心功能。临床试验也证实MSC移植治疗心肌梗死可改善急性心肌梗死后左室收缩功能,且未发现负性临床事件如支架内再狭窄、致心律失常作用。虽然基础研究和临床实验都证实MSC移植治疗心肌梗死是安全有效的,但是大量的证据表明MSC移植对心功能的改善是轻中度的,大部分研究结果显示MSC移植对心功能的改善只有5-6%左右,而有些临床试验甚至没有观察到心功能的改善。其中很关键的因素是MSC移植后大部分细胞不能在移植局部存活。研究报道90%的MSC在移植后1天内死亡,因此,提高MSC的存活率是提高干细胞移植疗效的关键。刺激新生血管的形成对缺血性心肌病有很好的治疗效果。促进心肌梗死区域的新生血管形成是MSC移植能改善心功能恢复的机制之一。因此,有理由假设,增强MSC的促新生血管形成能力将进一步提高心肌梗死后MSC移植的治疗效果。缺氧预处理(HP)是通过非致命的低氧刺激激活内源性的保护性反应,包括保护性蛋白的激活,从而提高细胞或机体的抗凋亡能力。缺氧预处理在其他许多细胞系中已被作为一种保护细胞凋亡和刺激血管再生的有力工具,但缺氧预处理是否能增强骨髓间充质干细胞的存活和促新生血管形成目前未有报道。实验目的:研究缺氧预处理是否能增强骨髓间充质干细胞(MSC)存活能力,是否能增强MSC的促新生血管形成能力,移植缺氧预处理后的MSC能否进一步提高心肌梗死后的心功能恢复,并探讨其作用机制。实验方法:将取自GFP小鼠的MSC在体外培养后分为两组,正常氧培养组(N-MSC)和缺氧预处理组(HP-MSC),HP-MSC为0.5%O2浓度下培养24小时。为明确HP对MSC的细胞生长因子和抗凋亡基因蛋白表达的影响,通过western检测了两组细胞的促红细胞生产素(EPO)及其受体(EPO-R),血管生产素1(Ang-1),血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(Flk-1)的表达情况,以及NF-κB、bcl-2、bcl-xl、caspase-3的表达情况;为了评价HP对MSC存活的影响,在体外,通过去血清培养24小时诱导细胞死亡,并用台盼蓝染色测定各组细胞的死亡率,caspase-3染色测定细胞的凋亡;为了进一步证实移植后HP-MSC是否有更强的存活能力和促新生血管形成能力,是否能更好地改善心肌梗死后的心功能恢复,进行了体内实验。体内实验分sham组、MI对照组、MI+N-MSC移植组,MI+HP-MSC移植组。通过结扎左前降支动脉建立大鼠心肌梗死模型,30分钟后,根据分组情况移植细胞,MI对照组移植等量的DMEM。移植后24小时和72小时,分别处死动物,心脏冰冻切片标本行TUNEL染色和caspase-3染色检测移植细胞的死亡率和凋亡率。移植后6周,行颈内动脉插管通过Powerlab系统测定心脏血流动力学,而后处死动物,心脏冰冻切片标本行血管内皮细胞标志CD31、平滑肌肌动蛋白(SMA)染色评价新生血管形成情况,通过肌球蛋白重链(MHC)染色评价移植细胞的分化情况,行HE染色和Masson三色染色测量心肌梗死的面积。实验结果:正常培养下的MSC表达EPO,Ang-1,VEGF,Flk-1,EPO-R多种生长因子,缺氧预处理能增加MSC这些生长因子的表达;缺氧预处理能激活NF-κB,并上调bcl-2,bcl-xl的表达,下调促凋亡基因caspase-3的表达;缺氧预处理本身并不增加MSC的死亡,去血清培养后,N-MSC和HP-MSC的caspase-3阳性细胞和台盼兰阳性细胞均明显增加,然而HP-MSC组的caspase-3阳性率和台盼兰阳性率明显低于N-MSC组,说明HP能保护MSC在去血清条件下的死亡;体内移植后,HP-MSC移植组在移植后24小时和72小时的移植细胞TUNEL阳性率和caspase-3阳性率均明显比N-MSC组低。移植后6周,MHC染色显示只有少量的MSC发展为心肌样细胞,但不能确定是分化为心肌细胞还是与宿主细胞融合。CD31和SMA染色显示细胞移植组总的血管密度/面积和动脉血管密度/面积较MI组显著增加,而HP-MSC移植组较N-MSC移植组增加更加明显,说明HP-MSC有更强的新生血管形成能力。HE染色和Masson三色染色显示细胞移植后能缩小心梗面积,且HP-MSC移植组的心梗面积最小。6周后,经血流动力学测定各组心功能的恢复情况,显示MI后,左室收缩压(LVSP)、左室压力上升的最大速率(+dp/dt)和左室压力下降的最大速率(-dp/dt)较sham组明显下降,左室舒张末压力(LVEDP)明显升高;在两组细胞移植组,LVSP、+dp/dt和-dp/dt均得到明显改善,但HP-MSC移植组心功能的改善较N-MSC移植组更加明显。说明HP-MSC移植能更好地改善心肌梗死后的心功能恢复。实验结论:1、缺氧预处理能提高MSC多种细胞因子的表达,包括EPO、EPO-R、Ang-1、VEGF、Flk-1,能激活NF-κB,上调bcl-2,bcl-xl的表达,进而增强MSC在体内体外的存活能力。2、缺氧预处理能增强MSC的新生血管形成能力。3、HP-MSC移植能更好地改善心肌梗死后心功能的恢复。