论文部分内容阅读
目的:探讨PTEN对spastin磷酸化调控AMPA受体GluA1亚基转运的影响。材料与方法:首先运用点突变技术构建spastin 210位点磷酸化突变体,转染海马神经元,通过免疫荧光观察spastin磷酸化对神经元树突生长的影响和膜表面GluA1的变化,膜片钳全细胞模式记录各组m EPSC的变化;然后构建PTEN及截短片段的原核与真核表达载体,运用GST pull-down和Co-IP实验进一步证实两者之间相互作用,及潜在的结合部位;接着在HEK293细胞中过表达PTEN与spastin,或共表达spastin和si PTEN,通过Western blot检测spastin磷酸化水平,分析PTEN能否去磷酸化spastin;之后在海马神经元中分别敲减和过表达PTEN,通过免疫荧光观察PTEN对神经元树突生长的影响和膜表面GluA1表达变化,膜片钳全细胞模式记录m EPSC的改变;最后在海马神经元中过表达PTEN并敲减spastin,观察神经元m EPSC的变化,分析PTEN是否通过去磷酸化spastin调控AMPA受体转运介导树突棘可塑性。结果:1.海马神经元过表达spastin及其210位点磷酸化突变体质粒,sholl分析结果显示去磷酸化降低海马神经元树突长度和分支数,膜片钳统计结果显示m EPSC的频率和幅度明显减小,免疫荧光结果显示细胞膜表面GluA1表达减少(P<0.05),而spastin磷酸化促进神经元树突长度和分支数,增大m EPSC的频率和幅度,增加细胞膜表面GluA1表达(P<0.05)。2.成功构建PTEN及其截短片段原核、真核表达载体,GST pull-down和Co-IP实验证明PTEN与spastin存在相互作用,具体结合部位在spastin的MIT区和PTEN的C-末端。HEK293细胞过表达及敲减PTEN后,Western blot结果显示过表达PTEN使spastin S210D表达减少,敲减PTEN使spastin S210D表达增加(P<0.05)。3.海马神经元过表达PTEN,sholl分析结果说明神经元树突长度及分支减少,膜片钳统计分析显示m EPSC频率和幅度显著减小,免疫荧光结果显示细胞膜表面GluA1表达减少(P<0.05)。海马神经元敲减PTEN,sholl分析结果显示神经元树突长度增加,分支增多,膜片钳统计分析显示m EPSC频率和幅度明显增加,免疫荧光结果显示细胞膜表面GluA1增加(P<0.05)。4.海马神经元中过表达PTEN并敲减spastin,与过表达PTEN组相比,膜片钳统计分析显示m EPSC频率和幅度显著增大(P<0.05);而与敲减spastin组相比,m EPSC的频率和幅度均无明显变化(P>0.05)。结论:1.Spastin Ser210磷酸化后促进神经元树突生长及膜表面GluA1表达,去磷酸化后抑制树突生长及膜表面GluA1表达。2.Spastin与PTEN存在相互作用,两者具体结合部位为spastin的MIT结构域和PTEN的C-末端。3.PTEN去磷酸化spastin抑制AMPA受体GluA1亚基的转运介导树突棘可塑性。