随着农工业的快速发展,广谱抗菌剂三氯生(Triclosan,TCS)被广泛的添加于农业产品、食品包装以及洗护用品中,因此,大量的三氯生在环境中被检出。这也使得其生态安全性及对生物体的毒理效应逐渐成为研究热点。本文以实验室模式动物斑马鱼为受试对象,系统的研究了三氯生对斑马鱼性别分化和生殖毒性的干扰作用及其分子机理,并初步获得了以下结论:1.为了验证TCS对斑马鱼性别分化的影响,将24hpf的斑马鱼胚胎分别暴露于50μg/L、100μg/L以及200μg/L的TCS并持续暴露至60dpf,结果表明,在200μg/L TCS处理组中,发育为雌性的斑马鱼个体数明显增加,雌性比例达到了84.67%。为进一步研究TCS影响斑马鱼性别分化的作用机理,在幼鱼性别分化的各关键时期(7dpf、30dpf以及45dpf)检测其性别分化相关基因的表达及性激素含量的变化。结果显示,7dpf的斑马鱼体内,与发育为雄性相关的基因dmrt1在200μg/L处理组表达显著下调,而在30dpf以及45dpf时sox9a和dmrt1在200μg/L处理表达也出现显著下调。而与发育为雌性相关的基因如brac2、芳香化酶基因(cyp19a和cyp19b)、sox9b等均呈现不同程度的表达上调,且在200μg/L TCS处理组上调效果显著。通过对性别分化完成期的45dpf斑马鱼幼鱼体内性激素(雌二醇和睾酮)含量进行检测,结果表明100μg/L及200μg/L处理组斑马鱼体内雌二醇含量和睾酮含量分别出现显著增高和显著降低现象,表明其可能诱导斑马鱼体内雌性激素的合成与分泌,从而猜测TCS可能会诱导斑马鱼发育为雌性,性别比例统计结果也证实了这一点。2.为了验证TCS对成年斑马鱼生殖系统的影响,将雌、雄斑马鱼分别暴露于50μg/L、100μg/L以及200μg/L的TCS 15天和30天,并设置空白对照组和溶剂对照组。结果表明,其体内性腺组织结构出现病变,200μg/L处理15天后,雄性斑马鱼睾丸组织中精子密度显著降低,继续暴露至30天后,在100μg/L及200μg/L处理组均出现严重的睾丸内部空泡化现象。而雌鱼的卵巢内部在TCS作用15天后出现成熟卵母细胞比例下降和质膜分离等现象;而30天后,200μg/L处理组出现大量卵母细胞膜破损现象。性类固醇激素及卵黄蛋白原含量的检测结果则表明在较高浓度的TCS(100μg/L和200μg/L)作用下,雌二醇及卵黄蛋白原含量均达到显著上升效果,睾酮和11-酮基睾酮含量则下调明显;这些结果表明TCS对斑马鱼的生殖系统存在一定的干扰作用。为进一步研究其作用机制,利用实时荧光定量PCR技术检测TCS暴露后下丘脑-垂体-性腺轴相关基因的表达情况。结果显示,促性腺激素释放激素及其受体基因在TCS作用下表达呈现不同程度的上调,如200μg/L的TCS作用下,gnrh3在15天和30天的雌、雄斑马鱼脑部均出现表达显著上调。类固醇转运蛋白及芳香化酶基因如star、cyp19a等基因在各处理组均出现显著上调,脑型芳香化酶基因cyp19b在TCS暴露15天后上调现象明显,持续TCS暴露至30天后,雄鱼脑中cyp19b的上调效果会有所抑制,可能是由于雌二醇的负反馈机制所导致。催化胆固醇合成性类固醇的途径中的3βhsd、17βhsd等基因也出现TCS暴露15天后显著上调和30天后上调效果不明显的现象,可能也是由于雌激素的作用于胆固醇合成起点的反馈作用。3.通过之前的研究,可初步判定TCS对斑马鱼存在雌激素效应,为进一步研究雌激素在斑马鱼性腺靶细胞中的转导途径,将斑马鱼暴露于50、100、200μg/L的TCS 30天后,检测其性腺中与雌激素信号转导相关的基因表达。结果显示在雌鱼性腺中,雌激素受体erα及erβ的表达没有出现显著变化,但与mER介导的cAMP途径及MAPK途径密切相关的基因如gper1、prkacaa、adcyap1a、efgra等基因在200μg/L组出现显著上调,表明高浓度的TCS可能诱导雌激素在雌鱼体内经这两种途径转导进入靶细胞;在雄鱼精巢中,erα表达上调效果明显,akt1表达下调,表明TCS可能会抑制PI3K途径的发生,使得nER的介导作用更加明显,而cAMP途径及MAPK途径则受TCS影响不大,表明TCS作用于雄鱼后,mER介导的雌激素快速信号转导途径受到一定的抑制作用。总而言之,TCS对雌激素在斑马鱼性腺中的转导产生了一定的影响。