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结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致以呼吸系统感染为主的慢性传染病。唯一的预防疫苗卡介苗(bacille calmetteguerin, BCG)保护性不完善,需有效的疫苗来控制TB的传播与蔓延。结核分枝杆菌亚单位疫苗的研究有望解决卡介苗预防结核效果不稳定的问题。研究发现MTB培养上清滤液蛋白(culture filtrate protein, CFP)中Ag85B和ESAT6均能刺激机体产生保护性免疫反应,是机体抗结核感染的有效靶抗原。因此,本试验通过构建融合表达Ag85B-ESAT6的原核表达载体,获得Ag85B-ESAT6融合蛋白,测定分析该蛋白在小鼠体内的免疫学特性和抵抗MTB感染的保护力。1.采用PCR方法分别从MTB H37Rv株DNA基因组中扩增Ag85B和ESAT6基因,在ESAT6基因上游引入48bp的柔性linker结构,确保两蛋白的正确折叠。将各目的片段克隆至pMD18-T载体中进行测序。鉴定阳性重组质粒pMD18-T-Ag85B和pMD18-T-ESAT6,经测序证实与Genebank公布的基因序列完全一致。将Ag85B和ESAT6基因亚克隆入pPROEXHTa原核表达载体,酶切鉴定阳性重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE检测和Western-blot鉴定表明,在相对分子量为45 kD的位置有特异性目的蛋白表达。采用Ni-NTA亲和色谱柱在变性条件下纯化得到了Ag85B-ESAT6融合蛋白。2.用Ag85B-ESAT6原核表达融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA检测证明,免疫小鼠血清中的特异性抗体滴度达到1∶12 800。将BALB/c小鼠用MTB毒株H37Rv经尾静脉注射感染。4周后,脱颈处死小鼠,无菌条件下进行脾脏和肺脏匀浆,倍比稀释后接种于7H10平板,37℃培养3～4周,计数细菌菌落形成单位(cloning forming units,CFU),以观察免疫小鼠对MTB毒株攻击的抵抗作用。结果表明,与生理盐水组相比,试验组和BCG组对MTB在脾脏和肺脏中的增殖均有抵抗作用(P <0.05);但与BCG组相比,试验组对MTB在脾脏和肺脏中增殖的抵抗作用不如BCG组(P >0.05)。在大肠杆菌表达系统中成功表达并纯化出Ag85B-ESAT6融合蛋白,该蛋白能够分别与Ag85B和ESAT6的mAb发生特异性反应,表明具有一定的生物活性。小鼠免疫结果显示:Ag85B-ESAT6能诱发一定水平的细胞免疫应答和体液免疫应答,并产生一定的免疫保护力,可以抵御MTB的感染。为进一步研究Ag85B-ESAT6疫苗的免疫学特性及与其他疫苗的优势组合,用于TB新型疫苗的开发提供了实验数据和物质基础。