第一部分东北红豆杉针叶的化学成分研究东北红豆杉,也称紫杉、赤柏松、朱树,为红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物,主要分布于中国东北、日本、朝鲜、俄罗斯等温带针阔叶混交林区。以茎、枝、叶、根入药,有抗癌功能,并有抑制糖尿病及治疗心脏病的效用。东北红豆杉(Taxus cuspidata)主要化学成分有二萜类、萜类生物碱、木脂素及黄酮类等,其中最引人注目的化学成分就是二萜类化合物紫杉醇。紫杉醇以其独特的抗肿瘤作用机制及显著的抗癌疗效引起了药学工作者对紫杉烷类化合物的研究热潮,目前紫杉醇已成为全世界癌症药物销售量最大的药物之一。红豆杉全世界仅有11种,分布范围狭窄,生长又极为缓慢,加上紫杉醇在树皮中的含量又很低,这就大大地限制了紫杉醇的开发利用。为减少对野生红豆杉资源的破坏,缓解紫杉醇供不应求的局面,我们对东北红豆杉针叶的化学成分进行研究。目的:以东北红豆杉(Taxus cuspidata)可再生针叶为研究对象,利用现代分离手段对其化学成分,尤其是紫杉烷类化学成分进行系统研究,并采用波谱学及光谱学方法,包括:1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC、HMBC、NOESY、UV、IR、MS等对分离得到的单体化合物进行平面结构和立体结构的鉴定,为寻找新的抗癌活性先导化合物或药物奠定基础。方法:取干燥后的东北红豆杉针叶约3.2 Kg,用95%的乙醇冷浸提取,浓缩后得到总提物。将总提物分散于蒸馏水中,石油醚脱脂后用乙酸乙酯进行萃取,得到乙酸乙酯部位。依次用5% HCl水溶液、5% Na2CO3水溶液对乙酸乙酯部位进行萃取,得到东北红豆杉针叶的碱性部位约4.2 g、酚性部位约3.4 g、中性部位约82 g。采用硅胶柱色谱法、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、制备薄层色谱法和制备高效液相色谱法对以上三个部位的化学成分进行分离,得到的单体化合物利用薄层色谱法及高效液相色谱法进行纯度检识。单体化合物采用UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC、HMBC、NOESY等光谱学和波谱学方法进行化学结构的鉴定。结果:从东北红豆杉针叶中分离并鉴定了41个化合物,包括:37个紫杉烷类化合物,2个木脂素类化合物,1个倍半萜类化合物和1个苯丙素类化合物。鉴定结果如下:2’-Hydroxy taxine II (1)、2α, 9α, 10β, 13α-Tetraacetoxy-5α-(3’-methyl- amino-3’-phenyl)-propionyloxy-taxa-4(20), 11-diene (2)、9α-Hydroxy-2α, 10β, 13α-triacetoxy-5α-(3’-dimethylamino-3’-phenyl) butanoate-taxa-4 (20), 11-di- ene (3)、10β-Benzoxy-5α-(3’-dimethylamino-3’-phenyl) propanoxy-1β-hydr- oxy-7β,9α,l3α-triacetoxy-11(15→l)abeotaxa-4(20), 11-diene (4)、Taxinine (5)、1β-Acetoxy isodrimeninol (6)、9α, 10β, 13α-Triacetoxy-5α-cinnamoyl-taxa- 4(20), 11-diene (7)、2-Deacetoxyltaxinine J (8)、Taxinine B (9)、9α, 10β-Di- acetoxy-5α-cinnamoyltaxa-4(20), 11-dien-13α-ol (10)、Taxezopidine G (11)、7-Deacetoxytaxuspine J (12)、2-Deacetyltaxinine (13)、10-Deacetyl taxinine (14)、1-Hydroxy taxuspine C (15)、Taxagifine (16)、2-Acetoxy-5-deacetyl- taxusin (17)、2-Deacetoxy-5-decinnamoyltaxinine J (18)、2α, 9α, 10β- Triacetoxy-20-hydroxy-11,12-epoxytaxa-4-en-13-one (19)、Taxinine A 11, 12- epoxide (20)、Taxinine A (21)、5-Decinnamoyl taxinin J (22)、Decinnamoyl taxagifine (23)、10-Deacetyl-13-oxobaccatin III (24)、9-Deacetyl-9-benzoyl- 10-debenzoyl brevifoliol (25)、Baccatin III (26)、13-Oxobaccatin III (27)、Yunnanxane (28)、(3E, 7E)-10β, 13α-Diacetoxy-2α, 5α, 20-trihydroxy-3, 8- secotaxa-3, 7, 11-triene-9-one (29)、(3E, 7E)-2α, 10β, 13α-Triacetoxy-5α, 20- dihydroxy-3,8-secotaxa-3, 7, 11-trien-9-one (30)、Taxuspine G (31)、Taxezopi- dine F (32)、9-Dihydro-13-acetyl-baccatin III (33)、10-Deacetyl baccatin III (10-DAB) (34)、7, 9-Deacetyl-5-decinnamoyl taxinine J (35)、Taxol (36)、7-Epi-10-deacetyltaxol (37)、2α, 9α, 10β-Triacetoxy-13α-hydroxy-5α-O-(β- D-glucopyranosyl)taxa-4(20), 11-diene (38)、松柏醛(Coniferyl aldehyde) (39)、松脂素((-)-Pinoresinol) (40)、铁杉脂素(α-Conidendrin) ( 41)。结论:本研究对东北红豆杉(Taxus cuspidata)可再生针叶的化学成分进行了系统研究,采用的按碱性成分、酚性成分及中性成分进行分离的方法适用于本植物的成分分离。分离并鉴定的41个单体化合物中:2α,9α,10β-Triacetoxy-13α-hydroxy-5α-O-(β-D-glucopyranosyl)taxa-4 (20), 11-diene (38)为自然界中首次发现的新化合物。9α-Hydroxy-2α, 10β, 13α-triacetoxy-5α-(3’-dimethyl-amino-3’-phenyl)- butanoate-taxa-4(20), 11-diene (3)、10β-Benzoxy-5α-(3’-dimethylamino-3’- phenyl)-propanoxy-1β-hydroxy-7β, 9α, l3α-triacetoxy-11(15→l)-abeotaxa-4 (20), 11-diene (4)、2α, 9α, 10β-triacetoxy-20-hydroxy-11, 12-epoxytaxa-4-en- 13-one (19)、10-deacetyl-13-oxobaccatin III (24)、9-Deacetyl-9-benzoyl-10- debenzoylbrevifoliol (25)、13-Oxobaccatin III (27)、(3E, 7E)-10β, 13α-diace- toxy-2α, 5α, 20-trihydroxy-3, 8-secotaxa-3, 7, 11-triene-9-one (29)、(3E,7E)- 2α,10β,13α-triacetoxy-5α,20-dihydroxy-3, 8-secotaxa-3, 7, 11-trien-9-one (30)等8个化合物为首次自本植物中发现。结合本研究中所得化合物波谱数据及查阅文献,归纳总结出不同骨架紫杉烷类化合物的核磁共振氢谱特征,为此类化合物的快速结构鉴定提供了依据。第二部分飞机草化学成分研究飞机草(Eupatorium odoratum L)又名香泽兰,为菊科泽兰属多年生草本植物,属入侵我国的外来植物。原产地为中美洲,在南美洲、亚洲、非洲热带地区广泛分布;在我国主要分布于广东、海南、广西、云南、贵州(西南部)。飞机草全草入药,在我国亦是民间常用草药,具有散瘀消肿、解毒、止血和杀虫功效,主要用于跌打肿痛、疮疡肿毒、皮炎和外伤出血。对于飞机草化学成分研究文献报道较少,仅报道了一些黄酮类化合物和挥发油类成分,而对其活性的研究也仅限于初提物阶段。因此全面系统的研究其化学成分并寻找到其活性成分对于该植物在药学及农业领域的开发与利用,变害为宝具有重大意义。目的:本课题以飞机草全草为研究对象,对其化学成进行全面系统的研究,运用1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC、HMBC、NOESY、UV、IR、MS等波谱学及光谱学方法对得到的单体化合物进行平面结构和立体结构的鉴定,通过活性筛选寻找到该植物中的活性成分,为其开发与利用提供科学依据。方法:取粉碎后的飞机草药材19 Kg,用95%乙醇回流提取,得浸膏约1800 g。将浸膏分散于蒸馏水中,依次用石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯进行萃取,减压浓缩后分别得到石油醚部位29.5 g、二氯甲烷部位101.2 g和乙酸乙酯部位40 g。采用硅胶柱色谱法、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、制备薄层色谱法对以上三个部位的化学成分进行分离,得到单体化合物。采用UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMQC、HMBC、NOESY等光谱学和波谱学方法对各单体化合物进行化学结构的鉴定。对飞机草中分得的16个化合物进行了9株人肿瘤细胞增殖抑制活性测试,以及对PPARγ和肝X受体激动活性的测试。结果:从飞机草中分离得到35个单体化合物,对其中的28个化合物进行了结构鉴定,包括:8个黄酮类化合物,8个木脂素类化合物,7个醌类化合物,2个甾醇类化合物、1个酰胺醇酯类化合物、1个长链有机酸和1个萘醌衍生物。鉴定结果如下:飞机草素(1)、β-谷甾醇(2)、金色酰胺醇酯(3)、2, 6-二甲氧基对苯醌(4)、1, 2-亚甲二氧基-6-甲基蒽醌(6)、1-羟基-3-甲氧基-6-甲基蒽醌(9)、6或7-甲基茜草素(10)、EO-12(12)、1, 2, 4-三甲氧基-3-羟基-6-甲基蒽醌(13)、1, 2-二甲氧基-3-羟基-6-甲基蒽醌(14)、商陆素(15)、鼠李柠檬素(16)、4, 2’-二羟基-4’, 5’, 6’-三甲氧基查耳酮(17)、桃皮素(20)、刺槐素(21)、山柰素(22)、3’, 4’-二甲氧基木樨草素(23)、1, 4-二羟基-2-甲氧基-7-甲基蒽醌(24)、(-)-松脂素(25)、天师酸(27)、7-甲氧基松脂素(28)、5, 7-二甲氧基松脂素(29)、(-)-橄榄脂素(30)、臭矢菜素C或D(31)、(-)-杜仲树脂酚(32)、(-)-丁香树脂酚(33)、臭矢菜素A或B(34)、β-胡萝卜苷(35)。1, 2-二甲氧基-3-羟基-6-甲基蒽醌(14)对人非小细胞肺肿瘤细胞(PC-6)具有增值抑制活性(IC50,15.56μg/mL);飞机草素(1)对PPARγ具有较强的激动活性(EC50,1.10μg/mL)。结论:从飞机草中分离并鉴定了28个化合物,其中自然界中首次发现的新化合物5个,分别为:1, 2-亚甲二氧基-6-甲基蒽醌(6)、EO-12(12)、1, 2, 4-三甲氧基-3-羟基-6-甲基蒽醌(13)、1, 2-二甲氧基-3-羟基-6-甲基蒽醌(14)、5, 7-二甲氧基松脂素(29);该植物中首次发现的化合物16个,分别为:化合物3、4、9、10、16、20、23、24、25、27、28、30、31、32、33、34。首次发现1, 2-二甲氧基-3-羟基-6-甲基蒽醌(14)对人非小细胞肺肿瘤细胞(PC-6)具有增值抑制活性,其IC50为15.56μg/mL;首次发现飞机草素(1)对PPARγ具有较强的激动活性,其EC50为1.10μg/mL。第三部分土木香中活性成分的微生物转化研究微生物转化,即指外源性化学物或称底物在微生物体内经过多种酶催化的代谢转化过程。在天然药物化学研究中可用于进行活性化合物的结构修饰,丰富其化学结构,从中寻找到活性更好或副作用更小的先导化合物,继而进行新药的开发。另外,还可以通过体外生物反应过程模拟药物在人体内的代谢行为,获得一定量的代谢产物用于药物的体内代谢研究。异土木香内酯(Isoalantolactone )属桉烷型倍半萜内酯类化合物,为菊科旋覆花属植物土木香(Inula helenium L)的主要成分,本课题对收集自河北、内蒙、河南、四川等地的十余批次的土木香进行的含量测定结果表明,异土木香内酯的含量高达1.2~5.6%。药理学研究表明异土木香内酯具有较强的驱虫、抗原虫、抗菌等活性,具有开发为药物的潜力。本研究以异土木香内酯为研究对象,对其进行微生物转化的研究,为这一资源丰富、活性较好的单体化合物的开发利用做基础研究。目的:利用真菌对异土木香内酯进行生物转化研究,以期得到新的异土木香内酯衍生物或活性更强、毒性更小的化合物用于该单体的药物研发。同时模拟异土木香内酯在哺乳动物体内的代谢,为研究该单体在体内代谢,阐明其在体内发挥药效作用的物质基础提供基础研究。方法:取粉碎后的土木香根5 Kg用99%乙醇冷提,所得浸膏分别用石油醚、二氯甲烷进行萃取,采用硅胶柱色谱法和硝酸银硅胶柱色谱法制备得到异土木香内酯单体。以异土木香内酯为底物,对47株真菌进行筛选,选择转化率较高、转化多样性较好的真菌进行放大培养,培养结束后减压滤取发酵液,用乙酸乙酯进行萃取,经硅胶柱色谱分离得到转化产物,并通过MS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HMBC、HMQC等方法对转化产物进行结构鉴定。结果:从土木香根中分离得到包括异土木香内酯在内的5个单体化合物,分别鉴定为土木香内酯(1a)、异土木香内酯(1b)、β-谷甾醇(2)、5α-环氧土木香内酯(3)和双咖啡酸酯(4)。从47株真菌中筛选出2株真菌可对底物异土木香内酯进行生物转化,即刺囊毛霉AS 3.3450和黑曲霉AS 3.1858。选择转化多样性较好且转化效率较高的AS 3.3450进行放大培养,得到3个转化产物,分别鉴定为:3α-羟基异土木香内酯(Z-1a)、3α-羟基-11, 13-二氢异土木香内酯(Z-1b)和2α-羟基异土木香内酯(Z-2)。结论:从土木香根中分离得到5个单体化合物,均为该植物中的已知化学成分;硝酸银硅胶柱色谱法对于分离土木香内酯和异土木香内酯这对结构相似的同分异构体具有较好的分离效果;通过刺囊毛霉AS 3.3450对异土木香内酯进行生物转化得到的3个转化产物均为已知化合物。第四部分土木香药材HPLC指纹图谱研究及含量测定目的:建立土木香药材的指纹图谱,测定其主要成分土木香内酯和异土木香内酯的含量,为土木香药材的鉴别及质量控制提供依据。方法:指纹图谱研究的色谱条件:HICHROM C18 (250 mm×4.6 mm, 5.0μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温:25℃,检测波长254 nm;含量测定的色谱条件:HICHROM C18 (250 mm×4.6 mm, 5.0μm),流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液梯度洗脱(0～3 min,乙腈65%等度洗脱;3～10 min乙腈由65%线性梯度至55%;10～15 min乙腈55%等度洗脱),运行时间15 min。流速1.0 mL/min,柱温:25℃,检测波长220 nm。结果:1.采用HPLC-DAD法建立了土木香药材的指纹图谱,精密度试验:各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于0.2%和1.7%;重复性试验:各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于0.2%和2.8%;稳定性试验:各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于1.4%和1.8%。15批土木香药材的相似度在0.848~0.989之间。2.采用HPLC法建立了土木香内酯及异土木香内酯的含量测定方法,线性范围:土木香内酯0.571～2.86μg·L-1,异土木香内酯0.325～1.62μg·L-1;精密度试验:RSD分别为0.46%和1.13%;重复性试验:RSD分别为1.68%和0.85%;回收率试验:土木香内酯和异土木香内酯的平均回收率分别为98.5%和99.4%,RSD分别为1.37和1.00 (n=6);样品在24h之内稳定。15批土木香及土木香对照药材的土木香内酯含量在6.66~48.00 mg/g之间,异土木香内酯含量在12.64~55.67 mg/g之间。结论:本研究方法稳定可靠,重复性和精密度良好,可作为土木香药材的指纹图谱及含量测定的方法。首次建立了土木香药材的HPLC指纹特征图谱,建立了河北产土木香药材指纹图谱的共有模式,同时测定了两个主成分土木香内酯和异土木香内酯的含量,为该药材的质量控制提供了更为可靠和准确的方法。