刚地弓形虫是一种专性细胞寄生原虫，可以感染包括人类在内的几乎所有脊椎动物，并在世界范围内传播，引起人兽共患寄生虫病。同时弓形虫是一种机会性致病原虫,免疫功能正常的人感染后常呈隐性感染,但在艾滋病、恶性肿瘤、长期应用免疫抑制剂治疗的患者或其它免疫功能严重受损者，弓形虫是引发致死性病变的主要原因之一。弓形虫病是AIDS最常见的机会性感染疾病之一，也是引起中枢神经系统局灶性占位症状最常见的原因。随着国内艾滋病发病率逐年升高，弓形虫感染引起的相关性疾病发生率也在升高，在世界很多地方还发生过流行，给人类带来巨大的健康威胁和经济上的严重损失，因而受到了越来越大的重视。不同地区或同一地区不同宿主的弓形虫基因型不同。常规聚合酶链反应（polymerase chain reaction PCR）技术及其衍生技术广泛应用于克隆基因、基因测序、基因分型等医学基础和临床研究中。通过运用PCR技术对弓形虫基因进行研究，可将弓形虫基因型分为I型、Ⅱ型和Ⅲ型，I型是公认的强毒株，主要引起先天性弓形虫病。其余两型属弱毒株，Ⅱ型多见于人体感染，Ⅲ型多见于动物感染。弓形虫不同虫株基因组之间存在微小差异，这可能是导致不同虫株之间的毒力、感染力等方面差异的原因，不同基因型的弓形虫虫株对药物的敏感性也不同。通过对弓形虫株基因鉴定和分型为弓形虫群体生物学、流行病学、疾病的防治等提供重要的依据。本实验通过采集云南西部HIV阳性者的血液，对弓形虫IgG和IgM阳性的全血样本进行基因提取，运用巢式PCR和RFLP等技术分析，与弓形虫国际标准株进行比较，对云南西部HIV阳性者血液内分离的弓形虫SAG2基因(241bp、221bp)进行遗传标记的分析，探讨云南西部HIV阳性者感染弓形虫的基因型，为发病机制和感染免疫的深入研究及临床治疗提供依据。1.研究目的：了解云南西部HIV阳性者感染弓形虫的基本情况，初步分析并确定云南西部HIV阳性者感染弓形虫的主要基因型，从而为云南西部HIV阳性者弓形虫病的防治及其流行病学研究提供重要理论依据。2.研究方法：2.1样本收集收集云南省龙陵县、大理市、临沧市艾滋病防治机构的HIV阳性者血液样本，均经蛋白印迹(WB)试验阳性确证。2.2弓形虫抗体检测将收集到的HIV阳性者血清样本应用酶联免疫吸附试验（ELISA）进行弓形虫IgG和IgM抗体检测，筛选出弓形虫IgG和或IgM阳性的样本。2.3弓形虫基因提取及扩增、回收、纯化采用全血基因提取试剂盒对HIV阳性者弓形虫IgG和IgM阳性的血液样本进行基因提取；引用国际上比较成熟的引物及巢氏PCR技术对弓形虫SAG2基因进行扩增，经两轮扩增后电泳，全自动凝胶成像分析系统进行分析。对弓形虫SAG2基因扩增阳性的，用凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。2.4酶切用限制性内切酶Sau3AI和HhaI对弓形虫SAG2基因扩增阳性产物进行酶切，酶切后电泳结果与弓形虫标准株进行对比、鉴定，确定基因型。2.5测序将弓形虫SAG2基因扩增阳性的产物进行回收、纯化后，共挑选7份（1份纯化弓形虫速殖子、6份HIV阳性者血液样本）送到上海立菲测序有限公司进行测序，测序结果与Genbank上注册的弓形虫株基因序列进行对比分析。3.结果：3.1血清抗体检测本次检测共392份全血样本，其中弓形虫IgG抗体阳性114份，阳性率为29.1%；弓形虫IgM抗体阳性有13份，阳性率为3.3%。本次检测共挑选出127份弓形虫抗体阳性的HIV阳性者全血样本。3.2基因扩增及酶切本实验对SAG2基因扩增阳性的120份全血样本进行酶切，电泳成像后分别可见一大小约241bp、221bp的条带，分别经两个酶切后见到目的基因条带，与国际弓形虫标准基因型株（RH株）进行对比。由于本实验室缺乏Ⅱ型和Ⅲ型弓形虫标准株，根据参考文献进行对比分析，结果119份与国际标准株（RH株）一致，只有1份与Ⅲ型一致。3.3序列分析云南西部HIV阳性者感染弓形虫株SAG2基因测序6份，6份源于随机选择的酶切标本。虽然各弓形虫株SAG2基因之间的差异率非常小，但6份弓形虫株进行基因测序的部分碱基对仍存在缺失、插入或突变。将弓形虫标准株（RH）、云南省HIV阳性者感染弓形虫株（样本）和Genbank注册的弓形虫株基因序列进行对比分析，它们之间的碱基对差异主要有以下几处：241bp的差异：样本3、4、7在第182对碱基处有G的缺失。221bp的差异：样本4在第31对碱基处G变为C，第48对碱基处G变为A，第163对碱基处有T的缺失；样本5在第84对碱基处G变为T，第163对碱基处G变为A；样本6在第163对碱基处G变为C，C后插入了A；样本2、3、7在第163对碱基处T变为C，第165对碱基处G变为A。可见样本4的碱基变化较多，说明与标准株（RH）基因型不一致，有可能是其它基因型，而样本4酶切结果初步确定为Ⅲ型，恰好与测序结果一致。因此，完全排除了样本4不是I型，要完全确定样本4是否是Ⅲ型有待进一步研究。4.结论4.1云南西部HIV阳性者弓形虫感染率高于全国正常人群的平均水平。4.2初步确定云南西部HIV阳性者感染弓形虫的基因型主要以Ⅰ型为主，Ⅲ型少见，未见基因Ⅱ型和其它基因型。5.本实验研究的创新点5.1本实验通过收集云南西部三地区艾滋病防治机构的HIV阳性者血液样本，进行弓形虫SAG2基因提取、扩增、酶切及序列分析，进一步结合弓形虫株B1基因、GRA6基因的研究结果进行综合分析，初步确定云南西部地区HIV阳性者感染弓形虫的基因型。5.2本实验主要有以下两个方面的创新点：5.2.1直接从云南西部HIV阳性者全血样本中提取弓形虫基因并成功扩增出弓形虫SAG2基因。5.2.2从SAG2基因位点进行分析，初步确定云南西部HIV阳性者感染弓形虫的基因型。