天麻素通过调控线粒体功能抗癫痫的作用研究

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[目的]探讨天麻素在癫痫大鼠模型中是否通过调控线粒体功能保护海马区星形胶质细胞和神经元的损伤。[方法]将72只SPF级SD大鼠随机分为3组:对照组、模型组、天麻素治疗组。天麻素治疗组于造模3天前以100mg/kg/天的剂量进行腹腔注射,对照组和模型组同时腹腔注射相同剂量的生理盐水。氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫模型后,依据Racine评分标准,观察行为学,记录发作频率和发作持续时间,匹罗卡品注射2h后,地西泮(10mg/kg)腹腔注射终止发作。分别于造模后24h、72h取材,进行以下检测:(1)HE染色、尼氏染色观察海马组织的形态结构和尼氏小体;(2)免疫荧光双标技术观察24h线粒体自噬通路蛋白Pink1、Parkin、LC3,线粒体动力相关蛋白1(DRP1)在星形胶质细胞、神经元的表达情况;(3)Western blot 检测 24h、72h 两个时间点 Pink1、Parkin、LC3、DRP1、p-DRP1-S616、Bcl-2、Bax在海马组织中的蛋白水平变化;(4)透射电镜观察线粒体形态学变化;(5)ATP检测试剂盒检测海马组织ATP含量;(6)TUNEL染色观察24h、72h星形胶质细胞和神经元的细胞凋亡情况。[结果](1)天麻素明显改善癫痫模型大鼠的发作程度。Racine评分结果显示,对照组无癫痫行为发作,癫痫模型组在给予匹罗卡品腹腔注射后,出现Ⅲ-Ⅴ级癫痫行为发作,与癫痫模型组相比,天麻素治疗后显著降低了 4级大发作的持续时间。(2)天麻素抑制癫痫大鼠海马神经元的病理损伤,调节星形胶质细胞的增殖。HE染色、尼氏染色结果显示,对照组细胞排列整齐,结构完整;癫痫模型组细胞肿胀,轮廓模糊、残存细胞排列稀疏、细胞质中尼氏小体减少;天麻素治疗组明显改善神经元形态不良状况,神经元数目增多,尼氏小体增多。同时,GFAP免疫荧光检测显示,天麻素治疗逆转了癫痫诱导的星形胶质细胞增生肥大。(3)天麻素改善了癫痫大鼠海马区神经元和星形胶质细胞的线粒体功能。Western blot结果显示,与对照组相比,癫痫模型组海马区线粒体自噬相关蛋白Pink1、Parkin、LC3表达上调,线粒体分裂相关蛋白p-DRP1-S616表达下调;通过免疫荧光技术验证发现,癫痫模型组海马区星形胶质细胞和神经元中上述蛋白出现相同的变化,而天麻素治疗后抑制线粒体自噬,促进线粒体分裂。通过透射电镜观察发现癫痫模型组线粒体嵴损伤水肿,形成空泡,线粒体伸长,并伴有嵴的溶解,天麻素治疗后,线粒体形态明显改善。进一步检测海马组织中ATP含量,癫痫模型组ATP含量显著降低,线粒体功能受损,天麻素治疗组使ATP含量明显升高,线粒体功能有所恢复。(4)天麻素抑制了海马区神经元和星形胶质细胞的细胞凋亡。海马组织中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax在24h时无变化,在72h时促凋亡蛋白Bax表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,天麻素治疗后逆转了海马组织中凋亡相关蛋白的表达。TUNEL染色检测海马区细胞凋亡发现,在24h时间点各组之间细胞凋亡差异不明显,在72h时,癫痫模型组星形胶质细胞、神经元细胞与凋亡细胞显著增加,天麻素治疗组则减少了星形胶质细胞和神经元细胞的凋亡。[结论]天麻素明显降低癫痫大鼠的痫性发作,抑制海马区神经元和星形胶质细胞损伤,其机制可能是调控海马星形胶质细胞和神经元线粒体自噬、促进线粒体分裂,改善线粒体功能,抑制细胞凋亡发挥抗癫痫作用。
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