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目前全球都面临着人口老龄化的严峻挑战。为理解衰老成因,各种衰老理论应运而生,包括经典的氧化应激致衰学说和近年因诺贝尔奖成果而开始热门的端粒学说,但这些衰老理论依然在持续发展中,例如氧化应激致衰学说仍需要完善以解释其矛盾现象,而人们对端粒学说的认识还不够充分。促进健康老龄化的重要举措之一是探索天然的延缓衰老营养成分。深海鱼油n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)防治衰老相关慢性病及其保护端粒长度的研究成果,提示n-3PUFA可能成为新型延缓衰老的功能因子。但是现有研究大多基于流行病学层面,缺少细胞与整体动物水平的深入研究,同时也缺乏针对端粒衰老预测因子等新兴方向的探索性机制研究。本论文以氧化应激致衰学说和端粒学说两大衰老学说为切入点,系统研究了n-3PUFA及其代表物质二十二碳六烯酸(DHA)的延缓衰老作用,并探索了其可能的端粒保护机制,同时通过与n-6PUFA对比研究了两者的功效差别。主要研究结果有:
(1)基于腹腔注射D-半乳糖诱导的氧化应激衰老模型,通过灌胃富含n-3PUFA的鱼油、n-6PUFA单体(花生四烯酸(AA))、n-3PUFA单体(DHA)以及作为对照的玉米油,进行为期2个月的干预实验。结果表明:①鱼油和PUFA单体可分别提高衰老小鼠肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(CAT)18%~46%和31%~65%活力,提高大脑SOD5%~38%活力,并抑制大脑单胺氧化酶(MAO)56%~90%活力,表明PUFA能保护衰老小鼠抗氧化防御体系,调控体内氧化还原平衡;②鱼油和PUFA单体能降低衰老小鼠25%~79%的血浆F2-异前列腺素含量,抑制16%~62%的大脑脂质过氧化水平,表明PUFA可降低体内氧化应激损伤;③鱼油和PUFA单体均能通过抑制c-Myc介导的端粒酶逆转录酶(Tert)蛋白表达而抑制40%~71%的端粒酶激活,这表明两者均具有抑癌的潜能。而n-3PUFA还能分别降低衰老小鼠肝脏和睾丸13%~25%、25%~27%的端粒缩短,并下调衰老标志基因和抑癌基因(p53和p16)表达(p<0.05),表明n-3PUFA具有延缓衰老、保护衰老-癌症平衡的潜能。
(2)利用第四代端粒酶敲除(G4Terc-/-)小鼠的原代小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞端粒快速缩短的特点构建便捷可靠的复制性衰老细胞模型,同时以同代龄的野生型(WT)MEF细胞作为年轻细胞对照,以不同浓度DHA在体外干预72h,结果表明:①25μM~100μM DHA均不影响年轻和衰老细胞的分裂增殖(p>0.05);②中浓度(50μM)DHA可降低衰老细胞5.5%的活细胞比例,诱导衰老细胞而非年轻细胞的凋亡,表明衰老细胞对DHA处理的敏感度高于年轻细胞;③高浓度(100μM)DHA可降低衰老细胞16%的端粒磨损,但各浓度DHA不影响年轻细胞的端粒长度(p>0.05),表明DHA能保护端粒较短的衰老细胞的端粒长度;④中浓度(50μM)和高浓度(100μM)DHA能抑制衰老细胞的衰老标志物β-半乳糖苷酶活性,还能分别降低衰老细胞28%和38%活性氧类(ROS)水平从而降低氧化应激。综上所述,DHA具有一定的体外延缓衰老能力,而其端粒长度保护作用可能与诱导衰老细胞凋亡、降低氧化应激有关。
(3)利用G4Terc-/-早衰小鼠模型缩小了端粒长度差异的种属局限,并排除了端粒酶激活诱导癌变的风险,从而有助于研究DHA的体内延缓衰老效果。以富含DHA的个性化饲料和空白饲料对G4Terc-/-小鼠以及作为对照的同龄WT小鼠进行为期10个月的长期干预试验,结果表明:①DHA能促进G4Terc-/-雄鼠体重增长,使其脂肪总质量增加3倍,从而抑制其体脂率下降,并将性腺白色脂肪的细胞形态恢复至正常水平,有效逆转了G4Terc-/-雄鼠在衰老过程中出现的弓背消瘦表型;但DHA干预对于雌鼠无明显作用。②G4Terc-/-小鼠体重下降的可能原因是其异常旺盛的分解代谢,DHA可通过增加G4Terc-/-雄鼠的耗氧量来缓解其无氧呼吸、改善能量代谢;但DHA干预却增加了WT雄鼠耗氧量、二氧化碳排放量,促进了能量消耗。以上结果表明,DHA能根据机体能量代谢状态发挥不同的能量代谢调节作用。③DHA的端粒保护作用存在脏器特异性,具体体现在:DHA干预可分别降低G4Terc-/-雄鼠心脏、肝脏和睾丸22%、26%和14%端粒磨损,但对于骨髓和外周血的端粒缩短没有显著作用(p>0.05)。④DHA干预能降低G4Terc-/-雄鼠的心脏脏器系数9%,提示了DHA对心肌肥大的潜在改善作用,但此作用与促进线粒体生物合成或保护线粒体结构完整无关。⑤DHA干预虽然不影响B、T淋巴细胞的分化成熟,但具有缓解G4Terc-/-雄鼠胸腺萎缩的趋势(p=0.08)。⑥DHA在干细胞数量维持、运动耐力和工作记忆提升方面无明显作用(p>0.05),表明骨髓和小肠等高增殖器官、肌肉、大脑可能不是DHA干预衰老过程的靶器官。
(4)研究表明,衰老的Terc-/-小鼠存在分解-合成代谢失衡的问题,体现在糖代谢方面为糖酵解速率和三羧酸循环中的葡萄糖氧化增加[1],而在脂质代谢方面尚无系统研究。通过分析G4Terc-/-雄鼠的脂质代谢特征,发现:①G4Terc-/-雄鼠肝脏脂质合成代谢中的脂肪酸合成酶(FAS)和甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)mRNA表达均比WT雄鼠降低了一半,同时脂肪酸β-氧化的关键催化酶中链酰基辅酶A脱氢酶(MACD)mRNA表达却增加了80%,表明G4Terc-/-雄鼠同时下调了脂质合成代谢与增强了β-氧化途径以促进脂质的分解代谢。②G4Terc-/-雄鼠肝脏的mTORC1磷酸化比WT对照减少了一半,并且mTORC1的上游分子Akt和下游分子Lipin磷酸化也分别降低了30%和35%。因此,G4Terc-/-雄鼠可能通过Akt-mTORC-Lipin1通路调控了其脂质代谢。研究表明,高糖饮食可通过纠正Terc-/-小鼠糖代谢而改善其衰老表型并延长寿命[1]。我们发现以富含DHA的个性化饲料进行长期干预也能显著改善G4Terc-/-雄鼠的糖代谢,体现在通过抑制胰腺郎格罕氏岛萎缩,加快胰岛素注射后的血糖恢复速度,进而改善胰岛素过度敏感的低血糖状态。因此,DHA改善G4Terc-/-雄鼠的糖脂代谢可能是其缓解端粒功能障碍引发的下游物质与能量代谢紊乱的重要途径。初步探究DHA调控G4Terc-/-雄鼠脂代谢的机制,结果表明:①DHA可将GPAT mRNA表达恢复至WT雄鼠水平,却不影响FAS和MACD mRNA表达。因此,DHA主要通过促进G4Terc-/-雄鼠肝脏甘油三酯合成过程中的甘油三磷酸途径,从而促进脂质合成代谢。②同时,DHA干预能分别增加WT和G4Terc-/-雄鼠mTORC160%和3倍磷酸化水平,同时具有提高G4Terc-/-雄鼠肝脏Akt磷酸化水平的趋势,但对于肝脏Lipin蛋白表达和磷酸化无显著影响。因此,DHA可能通过激活Akt-mTORC1通路调控G4Terc-/-雄鼠的脂质代谢,但此作用不依赖于mTOR下游分子Lipin。
综上所述,虽然n-3和n-6PUFA均能降低氧化应激衰老模型小鼠的体内氧化应激并抑制端粒酶激活,但只有n-3PUFA能保护端粒长度、下调衰老标志基因/抑癌基因,从而有助于维持衰老-癌症平衡;而在G4Terc-/-原代细胞和早衰小鼠模型中,我们均发现了n-3PUFA的非端粒酶依赖性的端粒保护作用:体外干预试验表明,DHA的端粒保护作用与其降低氧化应激、诱导衰老细胞凋亡有关;而长期体内干预试验表明,DHA对于部分器官的端粒保护作用、改善弓背消瘦的衰老表型可能与其调控能量与糖脂代谢有关。总体而言,n-3PUFA营养干预具有较好的延缓衰老功效。本论文丰富了n-3PUFA的功能研究领域,为n-3PUFA作为延缓衰老功能因子的生物学基础提供科学依据,也将为改善和预防老年性疾病的提供实际的饮食指导。
(1)基于腹腔注射D-半乳糖诱导的氧化应激衰老模型,通过灌胃富含n-3PUFA的鱼油、n-6PUFA单体(花生四烯酸(AA))、n-3PUFA单体(DHA)以及作为对照的玉米油,进行为期2个月的干预实验。结果表明:①鱼油和PUFA单体可分别提高衰老小鼠肝脏超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(CAT)18%~46%和31%~65%活力,提高大脑SOD5%~38%活力,并抑制大脑单胺氧化酶(MAO)56%~90%活力,表明PUFA能保护衰老小鼠抗氧化防御体系,调控体内氧化还原平衡;②鱼油和PUFA单体能降低衰老小鼠25%~79%的血浆F2-异前列腺素含量,抑制16%~62%的大脑脂质过氧化水平,表明PUFA可降低体内氧化应激损伤;③鱼油和PUFA单体均能通过抑制c-Myc介导的端粒酶逆转录酶(Tert)蛋白表达而抑制40%~71%的端粒酶激活,这表明两者均具有抑癌的潜能。而n-3PUFA还能分别降低衰老小鼠肝脏和睾丸13%~25%、25%~27%的端粒缩短,并下调衰老标志基因和抑癌基因(p53和p16)表达(p<0.05),表明n-3PUFA具有延缓衰老、保护衰老-癌症平衡的潜能。
(2)利用第四代端粒酶敲除(G4Terc-/-)小鼠的原代小鼠胚胎成纤维(MEF)细胞端粒快速缩短的特点构建便捷可靠的复制性衰老细胞模型,同时以同代龄的野生型(WT)MEF细胞作为年轻细胞对照,以不同浓度DHA在体外干预72h,结果表明:①25μM~100μM DHA均不影响年轻和衰老细胞的分裂增殖(p>0.05);②中浓度(50μM)DHA可降低衰老细胞5.5%的活细胞比例,诱导衰老细胞而非年轻细胞的凋亡,表明衰老细胞对DHA处理的敏感度高于年轻细胞;③高浓度(100μM)DHA可降低衰老细胞16%的端粒磨损,但各浓度DHA不影响年轻细胞的端粒长度(p>0.05),表明DHA能保护端粒较短的衰老细胞的端粒长度;④中浓度(50μM)和高浓度(100μM)DHA能抑制衰老细胞的衰老标志物β-半乳糖苷酶活性,还能分别降低衰老细胞28%和38%活性氧类(ROS)水平从而降低氧化应激。综上所述,DHA具有一定的体外延缓衰老能力,而其端粒长度保护作用可能与诱导衰老细胞凋亡、降低氧化应激有关。
(3)利用G4Terc-/-早衰小鼠模型缩小了端粒长度差异的种属局限,并排除了端粒酶激活诱导癌变的风险,从而有助于研究DHA的体内延缓衰老效果。以富含DHA的个性化饲料和空白饲料对G4Terc-/-小鼠以及作为对照的同龄WT小鼠进行为期10个月的长期干预试验,结果表明:①DHA能促进G4Terc-/-雄鼠体重增长,使其脂肪总质量增加3倍,从而抑制其体脂率下降,并将性腺白色脂肪的细胞形态恢复至正常水平,有效逆转了G4Terc-/-雄鼠在衰老过程中出现的弓背消瘦表型;但DHA干预对于雌鼠无明显作用。②G4Terc-/-小鼠体重下降的可能原因是其异常旺盛的分解代谢,DHA可通过增加G4Terc-/-雄鼠的耗氧量来缓解其无氧呼吸、改善能量代谢;但DHA干预却增加了WT雄鼠耗氧量、二氧化碳排放量,促进了能量消耗。以上结果表明,DHA能根据机体能量代谢状态发挥不同的能量代谢调节作用。③DHA的端粒保护作用存在脏器特异性,具体体现在:DHA干预可分别降低G4Terc-/-雄鼠心脏、肝脏和睾丸22%、26%和14%端粒磨损,但对于骨髓和外周血的端粒缩短没有显著作用(p>0.05)。④DHA干预能降低G4Terc-/-雄鼠的心脏脏器系数9%,提示了DHA对心肌肥大的潜在改善作用,但此作用与促进线粒体生物合成或保护线粒体结构完整无关。⑤DHA干预虽然不影响B、T淋巴细胞的分化成熟,但具有缓解G4Terc-/-雄鼠胸腺萎缩的趋势(p=0.08)。⑥DHA在干细胞数量维持、运动耐力和工作记忆提升方面无明显作用(p>0.05),表明骨髓和小肠等高增殖器官、肌肉、大脑可能不是DHA干预衰老过程的靶器官。
(4)研究表明,衰老的Terc-/-小鼠存在分解-合成代谢失衡的问题,体现在糖代谢方面为糖酵解速率和三羧酸循环中的葡萄糖氧化增加[1],而在脂质代谢方面尚无系统研究。通过分析G4Terc-/-雄鼠的脂质代谢特征,发现:①G4Terc-/-雄鼠肝脏脂质合成代谢中的脂肪酸合成酶(FAS)和甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)mRNA表达均比WT雄鼠降低了一半,同时脂肪酸β-氧化的关键催化酶中链酰基辅酶A脱氢酶(MACD)mRNA表达却增加了80%,表明G4Terc-/-雄鼠同时下调了脂质合成代谢与增强了β-氧化途径以促进脂质的分解代谢。②G4Terc-/-雄鼠肝脏的mTORC1磷酸化比WT对照减少了一半,并且mTORC1的上游分子Akt和下游分子Lipin磷酸化也分别降低了30%和35%。因此,G4Terc-/-雄鼠可能通过Akt-mTORC-Lipin1通路调控了其脂质代谢。研究表明,高糖饮食可通过纠正Terc-/-小鼠糖代谢而改善其衰老表型并延长寿命[1]。我们发现以富含DHA的个性化饲料进行长期干预也能显著改善G4Terc-/-雄鼠的糖代谢,体现在通过抑制胰腺郎格罕氏岛萎缩,加快胰岛素注射后的血糖恢复速度,进而改善胰岛素过度敏感的低血糖状态。因此,DHA改善G4Terc-/-雄鼠的糖脂代谢可能是其缓解端粒功能障碍引发的下游物质与能量代谢紊乱的重要途径。初步探究DHA调控G4Terc-/-雄鼠脂代谢的机制,结果表明:①DHA可将GPAT mRNA表达恢复至WT雄鼠水平,却不影响FAS和MACD mRNA表达。因此,DHA主要通过促进G4Terc-/-雄鼠肝脏甘油三酯合成过程中的甘油三磷酸途径,从而促进脂质合成代谢。②同时,DHA干预能分别增加WT和G4Terc-/-雄鼠mTORC160%和3倍磷酸化水平,同时具有提高G4Terc-/-雄鼠肝脏Akt磷酸化水平的趋势,但对于肝脏Lipin蛋白表达和磷酸化无显著影响。因此,DHA可能通过激活Akt-mTORC1通路调控G4Terc-/-雄鼠的脂质代谢,但此作用不依赖于mTOR下游分子Lipin。
综上所述,虽然n-3和n-6PUFA均能降低氧化应激衰老模型小鼠的体内氧化应激并抑制端粒酶激活,但只有n-3PUFA能保护端粒长度、下调衰老标志基因/抑癌基因,从而有助于维持衰老-癌症平衡;而在G4Terc-/-原代细胞和早衰小鼠模型中,我们均发现了n-3PUFA的非端粒酶依赖性的端粒保护作用:体外干预试验表明,DHA的端粒保护作用与其降低氧化应激、诱导衰老细胞凋亡有关;而长期体内干预试验表明,DHA对于部分器官的端粒保护作用、改善弓背消瘦的衰老表型可能与其调控能量与糖脂代谢有关。总体而言,n-3PUFA营养干预具有较好的延缓衰老功效。本论文丰富了n-3PUFA的功能研究领域,为n-3PUFA作为延缓衰老功能因子的生物学基础提供科学依据,也将为改善和预防老年性疾病的提供实际的饮食指导。