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水稻(Oryza sativaL.)是我国重要的粮食作物。面对日益频繁的干旱、极端温度等非生物胁迫的影响,以及人口增长和生态环境的压力,传统的水稻育种方法难以满足需求。现代生物技术手段,特别是分子标记辅助选择、转基因技术,在改良水稻品种方面的重要性日渐凸显,大大加快了育种进程。通过转基因技术改良现有主栽品种或杂交亲本,可培育出新的高产、优质、多抗的水稻新品种或杂交组合。尽管粳稻的遗传转化取得了较大成功,但籼稻的遗传转化仍然存在困难。而全球80%的稻米生产来自籼稻。因此研究籼稻和粳稻在组织培养特性上差异的遗传机理,提高籼稻遗传转化效率,具有重要的理论和现实意义。 本研究针对籼稻组织培养特性进行分子遗传学研究,构建具代表性的遗传群体,通过对愈伤组织诱导率,愈伤组织继代能力,以及愈伤组织分化能力等性状的研究,初步定位相关性状的QTLs位点,并用生物信息学方法加以验证。全面研究亚硝酸还原酶和无机氮源对籼稻转化的影响,同时针对影响籼稻转化率的一些关键环节和因素进行系统优化,初步建立适合93-11(重要的籼稻骨干亲本)的农杆菌介导转化体系。具体结果如下: (1)以籼稻93-11为母本,粳稻日本晴为父本,构建了含190个株系的重组自交系群体。使用202个遗传标记,通过复合区间作图,检测了与水稻成熟胚组织培养特性相关的QTLs。使用6个指标来评价成熟胚组织培养特性,分别为胚性愈伤诱导率、愈伤继代能力、分化率、平均分化苗数、绿苗分化率和平均分化绿苗数。日本晴的组织培养特性好于93-11,除愈伤继代能力外的指标外,其余指标均优于93-11。共检测到21个有关QTLs,定位到水稻的8个染色体上。其中4个QTLs与胚性愈伤诱导率有关,5个QTLs与愈伤组织继代能力有关,3个QTLs与分化率有关,2个QTLs与平均分化苗数有关,4个QTLs与绿苗分化率有关,3个QTLs与平均分化绿苗数有关。 (2)以检测到的21个QTLs所在的标记区间为候选的染色体区间,通过分析基因芯片的数据,寻找位于候选区间内,93-11相对日本晴显著下调和上调表达的基因。初步筛选到17个下调表达基因,并对其中16个进行了real-time PCR分析鉴定,扩增结果较好的有14个。其中8个在93-11中未检测到表达,LOC_Os04958060下调表达2倍,其余5个基因在93-11中显著下调表达均在4倍以上。初步筛选到7个候选的上调表达的基因,经过real-time PCR分析鉴定,其中2个基因在日本晴中未检测到表达,4个基因在93-11中显著上调表达,其中LOC_Os01965000.1编码产物为铵转运蛋白。通过real-time PCR了分析其他与氮代谢有关的基因,在93-11和日本晴中的表达水平。发现与氨同化有关的OsGS1;1,OsGS2和OsNADH-GOGA T2表现为上调表达,与硝酸盐和铵盐的转运有关的OsNR T1;1和OsAMT3;2也表现为上调表达。 (3)不同水稻品种亚硝酸还原酶NiR的酶活与表达量存在差异,93-11的酶活低,但表达量高;而日本晴的酶活高,但表达量低。比较两品种NiR的氨基酸序列,发现有两个位点的差异。构建日本晴和93-11的NiR的超表达载体和RNAi干扰载体,对93-11和日本晴的愈伤组织进行转化实验表明,超表达NiR能显著提高93-11的抗性愈伤组织比例,但对分化影响很小;而RNAi干扰NiR表达,降低了两个品种的抗性愈伤组织比例和分化效率。 (4)氮源的种类、配比和浓度对93-11愈伤组织的诱导和分化的影响均较大,在单一使用硝态氮或铵态氮条件下,都不能诱导出胚性愈伤组织;适合93-11的[NO3-]/[NH4+]为20 mM/20 mM,而适合日本晴的[NO3-]/[NH4+]为40 mM/10mM。 (5)比较了不同粳稻和籼稻品种的组织培养特性,针对籼稻93-11组织培养特性欠佳的问题,进行了系统的技术优化。结果表明:使用较高浓度的维生素、较大的组织培养空间以及添加乙烯抑制剂(30μM氯化钴)都能改善93-11的组织培养表现;1 mg/L KT+1 mg/L NAA+0.01 mg/L TDZ的激素配比可使93-11的愈伤组织分化率提高到33.29%;较早去除分化培养基中的潮霉素,可以促进愈伤组织的分化。 本研究为解释籼稻和粳稻在组织培养特性上差异的遗传机理,提供了有用信息;并对提高农杆菌介导的籼稻转化率,提供了新的思路;为培育具有良好组织培养特性的籼稻品种和杂交组合,建立了方法学和材料基础。