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子叶是大豆种子的主要营养储存器官,对种子萌发、幼苗生长甚至后续整个植株的发育都具有重要的作用。近年来,随着分子生物学和遗传学的发展,子叶发育的分子机制的神秘面纱逐渐被揭开。大量的研究表明这个过程具有非常复杂的网络调控,涉及到众多基因的互作、激素的诱导以及信号传导等。尽管如此,人们对子叶发育机理的认识还存在非常多的盲点。因此,本文以大豆子叶折叠突变体curled-cotyledon(cco)为实验材料,从生理、形态和分子机理等方面进行研究;通过转录组测序技术和荧光定量RT-PCR技术相结合筛选出两个基因:Glyma17G138200与Glyma03G02300,通过基因工程等实验手段进一步研究其功能。 本研究首先对cco突变体进行表型分析。相比于野生型,除生育期明显延长外,cco突变体的大部分农艺性状都没有明显变化。除此之外,cco突变体的株高、百粒重、下胚轴长度和萌发率都显著降低。cco突变体的遗传分析显示子叶折叠突变表型受3-4对基因控制。通过传统的石蜡切片方法进一步观察突变体早期的胚胎发育进程,发现子叶折叠突变表型起始于胚胎发育的球形期,且突变体鱼雷期胚的子叶相比于野生型分叉加大,尖端更锋利,像是“燕子的尾巴”。利用HPLC进行激素测定,结果显示cco突变体中生长素和脱落酸的含量显著增加,而赤霉素含量却显著降低。 为了明确大豆子叶折叠突变体的转录调控网络,筛选子叶发育相关基因,我们对其进行转录组分析。以错误发现率(False Discovery Rate: FDR)和|log2Ratio|≥1为标准,鉴定了1,093个差异表达基因,结果显示20.46%的差异表达基因参与了植物激素的生物合成和信号转导,包括生长素、细胞分裂素、赤霉酸、脱落酸、乙烯、油菜素甾醇和茉莉酸等。转录组的研究表明cco突变体中生长素和脱落酸的合成和信号转导都是增强的,而赤霉素的早期合成步骤受到了阻遏,非活性赤霉素向活性赤霉素的转变也受到了限制,这些结果同HPLC测定的结果一致。总之,cco突变体中多种激素合成和信号转导得到重排,这也很可能是突变体表现多向性缺陷的原因。将RNA-seq同荧光定量RT-PCR结合,我们筛选了两个基因Glyma17G138200(YABBY)与Glyma03G02300(LBD),进一步对其进行功能研究。 通过生物信息学的方法,在大豆基因组中一共鉴定了17个YABY基因。系统进化分析显示大豆YABBY家族分为5个亚家族:FIL、YAB2、YAB5、INO和CRC。Glymal7G138200属于FIL亚家族,因大豆基因组中存在此基因的另一个拷贝,故命名为GmFILa。GmFILa优势表达于叶片和发育的种子中,原位杂交结果显示它特异的在叶、萼片等侧生器官的远轴端表达。对GmFILa基因进行克隆,发现GmFILa cDNA全长648 bp,编码215个氨基酸,C端具有保守的锌指区,N端具有YABBY区域。洋葱表皮细胞瞬时表达系统表明GmFILa基因编码蛋白定位于细胞核上。最后通过酶切连接方法构建过表达载体pBI121-GmFILa转化拟南芥,进行功能验证。结果表明,GmFILa过表达拟南芥植株生育期延长、叶片狭长卷曲,且这种表型随着叶龄的增加更加明显。另外GmFILa还能阻止茎顶端分生组织的生长。对野生型和转基因株系叶片表皮细胞进行观察,结果显示GmFILa基因的过表达引起叶片近轴端表现为部分远轴化。生长素含量测定显示转基因植株的叶片中生长素含量显著降低。为了进一步探讨GmFILa基因作用的分子机理,我们对野生型和GmFILa过表达拟南芥植株进行了表达谱分析,发现差异表达基因同生长素合成和信号转导、胁迫等相关。总之,GmFILa基因特异的控制侧生器官远轴端的发育,对叶片的激发和腹背模式的建立具有重要的作用,且它的上调表达能够抑制自由态生长素的含量。cco突变体早期发育的种子中生长素含量显著增加,种子中GmFILa基因表达受到了抑制,推测GmFILa基因很可能通过调控生长素参与cco突变体的发育。 Glyma03G02300编码了LBD转录因子,命名为GmLBD1。大豆基因组中鉴定了86个LBD基因,系统进化分析显示GmLBDl同 AtLBD18、AtLBD19和AtLBD31聚为一支,暗示其功能相似性。GmLBD1位于3号染色体,cDNA全长为756 bp,编码251个氨基酸,基因组序列有两个外显子和一个内含子。洋葱表皮细胞瞬时表达系统表明GmLBD1基因编码蛋白定位于细胞膜和细胞核上。通过酶切连接方法构建过表达载体pBI121-GmLBD1,转化拟南芥。结果显示同野生型相比,转基因拟南芥侧根数目显著增加,且根中自由态生长素的含量显著增加。GmLBD1基因过表达能增加自由态生长素的含量,而生长素又能诱导GmLBD1基因的表达,于是GmLBD1基因和生长素之间形成了一个正反馈通路。本研究发现cco突变体表现根系减小,且GmLBD1在cco突变体根组织中的表达受到了显著抑制,推测GmLBD1基因的表达下降,引起了根中生长素含量的下降,从而导致突变体根系减小。因此,GmLBD1基因很可能通过控制生长素促进侧根的发育。