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研究背景神经干细胞是指分布于神经系统的、具有自我更新和多分化潜能的干细胞。其主要功能是作为一种后备储备，参与神经系统损伤修复或细胞正常的死亡更新。近年来研究发现成年哺乳动物和灵长类动物中枢神经系统存在干细胞。神经干细胞可以诱导分化成神经元或胶质细胞。Tau蛋白是一种重要的微管相关蛋白，广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统中。正常的Tau蛋白可以促进微管的组装，维持微管的稳定，连接其他细胞骨架蛋白等。在一些中枢系统疾病中，Tau蛋白被异常修饰，如过度磷酸化。这种被异常修饰的Tau蛋白丧失了Tau蛋白的生理功能，结果使微管解聚，细胞骨架遭到破坏，正常轴突转运系统受损，突触丢失及退行性变。体内研究表面，移植的神经干细胞表现出增殖、迁移并能够形成特定神经细胞类型，但在一些中枢系统疾病，神经元持续性丧失时，这种补充“救活”机制却没有发生，这可能和某些内外因素阻碍了这种神经干细胞的正常分化，抑制了其形成有相应功能的神经元有关。因此，研究神经干细胞分化过程中，Tau蛋白的磷酸化和影响Tau蛋白磷酸化的机制也就成为关键问题之一。因此本实验选取Tau蛋白有一定代表性的两个磷酸化位点Tau[pS396]、Tau[pS262]和磷酸化调节激酶GSK-3β，通过免疫细胞化学和免疫蛋白印迹的方法，在神经干细胞分化7天时检测这两个位点的磷酸化情况，并用Aβ25-35和LiCl进行干预，研究神经干细胞分化过程中，Tau蛋白的磷酸化状态和LiCl和Aβ25-35对Tau蛋白磷酸化的影响，并探讨Tau蛋白磷酸化的机制。实验方法无菌条件下从新生大鼠海马齿状回分离培养神经干细胞，用D／F培养液（含20ng／mL bFGF、20ng／mL EGF、2％B27）在37℃，5％CO2的条件下培养。神经干细胞培养到第3代时，撤除bFGF和EGF，加入10％的胎牛血清使其分化。第三代神经干细胞分化7天后分为三组：正常组；LiCl预处理组；Aβ组。观测细胞生长状态，收集细胞采用免疫细胞化学染色和Western-blot的方法检测Tau[pS396]、Tau[pS262]、GSK-3β[pTry279，216]在三组细胞中的表达情况。实验结果均采用SPSS10.0软件包分析。免疫细胞化学结果采用卡方检验，Western-blot结果采用单因素方差分析。实验结果1．培养36小时后对每组细胞进行形态上的观察，LiCl预处理组和Aβ组的活细胞计数少于正常组，其中Aβ组减少明显。在一些视野中可见正常组的贴壁细胞要多于其它两组，在一些视野中可见正常组贴壁细胞的突起的数量和长度要高于其它两组。在Aβ组和LiCl预处理组中，贴壁细胞的折光性也有所下降。2．正常组神经干细胞分化过程中Tau[pS396]、Tau[pS262]、GSK-3β[pTyr279，216]有表达，主要表现为细胞胞浆和轴突染色呈阳性结果。3．免疫细胞化学染色和Western-blot结果都显示，Aβ组和正常组细胞内Tau蛋白在Ser396位点，Ser262位点的磷酸化水平要高于LiCl预处理组（P＜0.01）。Aβ组和正常组细胞内GSK-3β[pTyr279，216]的表达要强于LiCl预处理组（P＜0.01）。实验结论1．神经干细胞分化过程中Tau蛋白具有一定程度的磷酸化水平。2．氯化锂（lithium Chloride，LiCl）可以抑制GSK-3β的活性，降低Tau蛋白磷酸化水平，而Aβ25-35可通过上调活化型GSK-3β的表达来提高经过LiCl预处理的Tau蛋白的磷酸化水平。