一、目的90%以上的胰腺恶性肿瘤为起源于腺管上皮的胰腺导管腺癌（pancreatic ductaladenocarcinoma，PDA），其恶性程度高，预后极差，早期即可发生淋巴道、大血管及远处器官转移，确诊时多数患者已达中晚期，丧失了最佳的手术治疗时机。至今仍缺乏可靠的早期诊断标志物和有效的治疗方法。USP22（ubiquitin-specific protease22）是一种泛素特异肽酶，属于去泛素化酶DUBs家族，是hSAGA复合物的一个亚单位，参与细胞周期的调控，并能够激活BMI-1、MYC、FBP1等介导的靶基因转录，在细胞周期调控、胚胎发育及端粒动态平衡等过程中发挥关键作用，被认为是肿瘤干细胞的标志物之一。目前已发现USP22的异常高表达与多种实体瘤的转移潜能、和预后密切相关，但且其与胰腺导管腺癌的关系尚未见报道。恶性肿瘤的侵袭和转移是导致患者治疗失败、预后不佳甚至死亡的最主要因素。最近的研究表明，上皮细胞-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）与胰腺导管腺癌的侵袭转移密切相关。EMT的发生使肿瘤细胞获得了向周围组织浸润和侵入邻近脉管系统的能力，并最终转移到其他的组织或器官形成转移灶。同时，通过对大样本的胰腺癌病理组织切片进行免疫组化分析发现，EMT的发生与胰腺癌的不良预后显著相关。但目前关于USP22的研究多集中在其调控细胞周期的作用上，而USP22异常表达促进肿瘤侵袭转移的潜在机制尚未见报道。本文旨在揭示USP22与胰腺导管腺癌临床预后的相关性，并初步阐明其在胰腺导管腺癌发生发展中的机制，为胰腺癌的早期诊断及靶向治疗提供新的思路。二、方法1、收集2002至2013年在大连医科大学附属第一医院及大连医科大学附属第二医院病理科存档石蜡组标本且临床资料完整的胰腺导管腺癌患者136例及癌旁正常组织42例。采用免疫组化法测定所有病理标本中USP22、FoxM1的表达情况，并对所有病例进行随访。分析USP22、FoxM1以及USP22/FoxM1共表达与PDA患者临床病理特征和预后的相关性。应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，以P＜0.05为显著性标准。表达率的组间差异比较采用χ2检验；预后的单因素分析采用Kaplan-Meier曲线，组间比较采用Log-Rank检验；预后的多因素分析采用COX回归风险模型。2、利用脂质体转染法将重组的USP22过表达质粒或USP22干扰质粒转染至人胰腺导管腺癌细胞系（PANC-1/CFPAC-1）中。并通过G418筛选稳定转染USP22干扰或过表达质粒的PANC-1细胞克隆。3、采用RT-PCR法检测USP22、FoxM1的基因表达。4、采用Western blot检测USP22、FoxM1、Wnt通路相关蛋白以及EMT标志蛋白的表达。5、采用间接免疫荧光方法检测USP22、FoxM1、β-catenin、F-actin、E-Cadherin以及Ezrin的表达。6、利用划痕及transwell实验观察和分析PANC-1细胞侵袭和转移能力。三、结果（一）USP22、FoxM1在胰腺导管腺癌中的表达及预后相关性研究1、PDA组织中USP22和FoxM1的表达显著高于癌旁正常组织（P<0.001），且USP22与FoxM1的表达呈明显的正相关（r=0.450，P<0.001）。2、配对的5例新鲜癌组织中USP22、FoxM1的表达均明显高于癌旁正常组织。同时，低分化的PANC-1细胞系中USP22、FoxM1的表达明显高于高分化的CFPAC-1细胞系。3、USP22的表达与PDA患者的淋巴结转移（P=0.009）和TNM分期（P=0.031）显著相关；FoxM1表达与PDA患者的组织分化（P=0.020）、淋巴结转移（P=0.015）和TNM分期（P=0.018）显著相关。同时，USP22/FoxM1共表达阳性与PDA患者的淋巴结转移（P=0.011）和TNM分期（P=0.041）显著相关。4、Kaplan-Meier分析显示，PDA患者中USP22、FoxM1阳性或USP22/FoxM1共表达阳性患者的OS较阴性患者明显缩短（log-rank P=0.033；log-rank P＜0.001；log-rank P＜0.001）（见图2）。5、单因素生存分析显示，USP22（HR:1.944；95%CI：0.895–2.996；P=0.034）、FoxM1（HR：1.823；95%CI：1.369–3.881；P＜0.001）、USP22/FoxM1共表达（HR：2.895；95%CI：1.346–4.237；P＜0.001）、组织分化、淋巴结转移及TNM分期与PDA患者的预后具有显著的相关性。6、模型A的多因素生存分析显示，USP22（adjusted HR：1.675；95%CI：1.008-2.146；P=0.027）、FoxM1（adjusted HR：1.732；95%CI：1.262-2.947；P=0.032）和TNM分期可以作为PDA患者的独立预后因素。7、模型B的多因素生存分析显示，USP22/FoxM1共表达（adjusted HR：1.328；95%CI：1.175–1.923；P=0.029）和TNM分期可以作为PDA患者的独立预后因素。（二）USP22通过促进β-catenin核内移上调胰腺导管腺癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性和FoxM1表达并诱导G1/S期转变的机制研究1、在PANC-1中干扰USP22的表达会导致Wnt/β-catenin信号通路活性下降，标志蛋白Axin2、LEF-1以及下游靶蛋白C-Myc的表达下调。在CFPAC-1中上调USP22的表达会导致Wnt/β-catenin信号通路活性下降，标志蛋白Axin2、LEF-1以及下游靶蛋白c-Myc的表达下调。2、PANC-1中伴随着USP22的梯度下降，细胞核内β-catenin的表达梯度下降而细胞浆中β-catenin的表达梯度上升，同时细胞核和细胞浆中FoxM1的表达均呈梯度下降；CFPAC-1中伴随着USP22的梯度上调，细胞核内β-catenin的表达梯度上调而细胞浆中β-catenin的表达梯度下降，同时细胞核和细胞浆中FoxM1的表达均呈梯度上调。另外，PANC-1细胞系中通过β-catenin过表达质粒上调β-catenin的表达后，即使利用USP22-siRNA下调USP22的表达，细胞核及细胞浆中FoxM1的表达也未发生明显变化，同时CFPAC-1中我们利用β-catenin-siRNA干扰β-catenin的表达后即使过表达USP22，细胞核及细胞浆中FoxM1的表达也均未发生明显变化。3、我们通过在PANC-1和CFPAC-1两个细胞系中过表达USP22或干扰FoxM1，发现USP22过表达后两种细胞的增殖都受到明显促进，而干扰FoxM1后两细胞系的增值均受到明显抑制。我们进一步的实验发现当在两个细胞系中干扰FoxM1的表达后，即使过表达USP22，两细胞系的细胞增殖均未见明显变化。另外，采用流式细胞技术检测发现，过表达USP22后，细胞周期中G1/S期转变加快，G1期所占比例下降明显，S期和G2/M期比例上升；干扰FoxM1后，细胞发生明显的G0/G1期阻滞。但当我们干扰FoxM1的表达后，即使过表达USP22，两细胞系的细胞周期均未见明显改变。4、过表达USP22后，两个细胞系中p21和p27有明显下调，并伴随着CyclinD1、Cdk4和Cdk6表达的上升；干扰FoxM1的表达后，，两个细胞系中p21和p27有明显上调，并伴随着CyclinD1、Cdk4和Cdk6表达的下降，但当我们在干扰FoxM1的表达同时过表达USP22，两细胞系G1期细胞周期相关蛋白的表达并未现显著变化。（三）USP22通过FAK信号通路促进Ezrin介导的细胞骨架重构和上皮间充质转化并诱导胰腺癌细胞侵袭转移的机制研究1、我们首先通过激光共聚焦-免疫荧光试验检测了Panc-usp及Panc-uspsh中F-actin的表达发现，Panc-usp中出现大量纵向排列的细胞质肌动蛋白纤维。而在Panc-uspsh中，actin的表达呈现点状，细胞质肌动蛋白纤维消失。之后我们检测了作为细胞膜分子和细胞骨架之间的重要调节蛋白和连接蛋白的Ezrin蛋白的表达，发现Panc-uspsh中Ezrin的表达主要集中在细胞质。有趣的是在USP22稳定过表达的Panc-usp细胞中，Ezrin的表达明显向细胞膜靠拢，细胞质中几乎消失。之后的Western blot结果发现，虽然在PANC-1、Panc-uspsh以及Panc-usp中Ezrin的表达并没有发生明显变化，但是Ezrin的磷酸化水平发生了明显改变。Panc-usp中P-Ezrin的表达6.4倍于Panc-uspsh中的表达。2、我们在Panc-usp中分别转染了control-siRNA及FAK-siRNA，结果发现随着FAK表达的下降，P-FAK的表达也相应下降，同时，P-Ezrin的表达也明显下调。与此同时，我们在Panc-uspsh中分别转染了空白质粒及FAK过表达质粒，发现随着FAK表达的上调，P-FAK的表达也随之上升，同时，P-Ezrin的表达也明显升高。3、Western blot的结果显示Panc-usp细胞中间充质细胞标志物N-钙粘蛋白、波形蛋白及纤维连接蛋白的表达较Panc-uspsh分别增加5.8、4.2、2.7倍，而上皮细胞分子标志E-钙粘蛋白在Panc-usp中表达比Panc-uspsh中表达减少了75.3%。对EMT相关转录因子的检测发现，Pancnnn-usp中ZEB1和Snail的表达分别5.6倍和5.3倍于Panc-uspsh中的表达。4、在Panc-usp细胞转染FAK-siRNA后，随着P-FAK的下调，间充质细胞标志物N-钙粘蛋白、波形蛋白及纤维连接蛋白的表达也分别下降了63.8%、81.3%、64.5%，而上皮细胞标志物E-钙粘蛋白的表达增加了4.2倍。EMT相关的转录因子ZEB1和Snail的表达也随着P-FAK的下调而分别下降了为86.2%和78.4%。而在Panc-uspsh细胞转染FAK过表达质粒后，随着P-FAK的上调，间充质细胞标志物N-钙粘蛋白、波形蛋白及纤维连接蛋白的表达分别增加了5.2、1.4、3.6倍，而上皮细胞标志物E-钙粘蛋白的表达下降87.5%。EMT相关的转录因子ZEB1和Snail的表达也随着P-FAK的上调分别增加了2.8倍和3.6倍。5、划痕及transwell试验发现，Panc-usp细胞的迁移及侵袭能力明显高于Panc-uspsh细胞，同时，Panc-usp中下调FAK的表达能够明显下调其迁移及侵袭率而Panc-uspsh中过表达FAK能够显著上调其迁移及侵袭率。四、结论（一）USP22、FoxM1在胰腺导管腺癌中的表达及预后相关性研究1、USP22、FoxM1在PDA中的表达显著高于正常组织，且两者的表达呈正相关，表明二者可能起协同作用参与了PDA的发生发展过程。2、USP22表达与PDA患者的淋巴结转移和临床分期相关，FoxM1与组织分化、淋巴结转移和临床分期相关，USP22/FoxM1共表达与淋巴结转移和临床分期密切相关，表明二者在PDA的侵袭转移中发挥作用。3、USP22、FoxM1、USP22/FoxM1共表达均与PDA患者的临床预后密切相关，且可作为PDA的独立预后因子。（二）USP22通过促进β-catenin核内移上调胰腺导管腺癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路活性和FoxM1表达并诱导G1/S期转变的机制研究1、胰腺癌细胞系中USP22的表达可影响Wnt/β-catenin通路活性。2、胰腺癌细胞系中USP22通过促进β-catenin核内移上调FoxM1的表达。3、胰腺癌细胞系中USP22可通过上调FoxM1表达促进G1/S期转变和细胞增殖。4、胰腺癌细胞系中USP22通过上调FoxM1影响G1期细胞周期调控蛋白的表达。（三）USP22通过FAK信号通路促进Ezrin介导的细胞骨架重构和上皮间充质转化并诱导胰腺癌细胞侵袭转移的机制研究1、PANC-1细胞系中Ezrin蛋白重分布及磷酸化在USP22导致的细胞骨架重构中起重要作用。2、PANC-1细胞系中过表达USP22可促进细胞由上皮细胞表型向间充质细胞表型转变。3、PANC-1细胞系中过表达USP22能够促进PANC-1细胞的侵袭和转移。4、PANC-1细胞系中USP22通过FAK信号传导通路促进Ezrin介导的细胞骨架重构和上皮间质转化。