矽肺病是因长期吸入游离SiO2粉尘所引起的一种常见的职业病,其典型病变是肺组织内矽结节形成和弥漫性肺间质纤维化。游离SiO2粉尘导致肺组织炎症损伤,机体持续损伤修复的同时也伴随细胞外基质的过度沉积,造成肺间质的不可逆性纤维化,最终导致呼吸功能障碍。由于这一过程涉及多种趋化因子、炎症因子、生长因子以及多种蛋白水解酶的调节,因此,尚未明确其具体的分子调控机制,从而给矽肺病的有效治疗带来了困难,使其成为威胁职业人群健康的一大公共卫生问题。细胞因子,是一类主要由免疫细胞分泌的、能调节细胞功能的小分子多肽,对细胞间相互作用、细胞的生长和分化有重要调节作用。近年来,多种细胞因子参与调节肺纤维化病理过程已广泛报道,对特定细胞因子功能的深入研究为阐明纤维化疾病分子机制提供了重要线索。除细胞因子外,蛋白水解酶也是肺纤维化过程中重要的调节蛋白,是催化多肽或蛋白质水解酶的统称,可降解细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)成分并激活其它蛋白,其失调可影响纤维化疾病的进程。这些广泛且功能庞杂的生物活性物质有可能成为肺纤维化疾病治疗的新靶点或诊断及预后的参考指标。因此,对这些生物活性物质功能的深入研究十分有意义。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是一类降解基质成分的蛋白酶,MMP-3是其中主要降解细胞间质成分的成员,又名间质溶酶素。其作用底物广泛,可降解多种ECM成分。此外,MMP-3还可通过水解蛋白上的特定结构从而促进蛋白的激活,参与炎症反应,组织修复,细胞迁移及上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)等多种生物学过程,从而参与调节多种疾病的病理过程,如类风湿关节炎,帕金森病,骨性关节炎等。但关于其是否调节矽尘诱导的肺纤维化过程尚无报道。目的：本研究先通过建立矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型,对小鼠肺组织进行细胞因子芯片筛检与分析,寻找与肺纤维化过程有密切关系的调节因子。并结合文献报道,选择可能影响肺纤维化发生发展的细胞因子进行进一步的验证,同时探讨其在肺纤维化过程中可能的作用及初步的分子机制。从而为矽肺病的发病机制提供新线索。方法：(1)建立矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型。单次气管内滴注Si02悬液,通过HE染色观察矽尘处理后不同时间点小鼠肺组织病理变化情况,确认小鼠肺纤维化模型成功建立；(2)小鼠肺组织细胞因子芯片筛检。分别选择对照组、矽尘处理3天、7天、14天、28天、56天小鼠的肺组织,由博奥公司用鼠细胞因子抗体定量芯片2000进行144种细胞因子表达的检测；(3)细胞因子表达结果分析。筛检出与对照组比较,至少两个矽尘处理组中差异表达两倍以上的细胞因子,分析其动态变化趋势；(4)根据细胞因子筛检结果及分析,结合文献报道,选择MMP-3蛋白进行验证。分别用Western blot和免疫组化方法检测肺组织中MMP-3及肺纤维化相关蛋白的表达情况,同时,用粉尘处理小鼠巨噬细胞(RAW264.7)和人支气管上皮细胞(HBE), TGF-β1处理小鼠成纤维细胞(3T3),Western blot检测MMP-3及其相关蛋白的表达；(5)用细胞模型探讨MMP-3在肺纤维化中可能的作用。通过小RNA干涉(siRNA) MMP-3的表达,Western blot检测促纤维化因子—转化生长因子(Transforming growth factor、TGF-β1)、成纤维细胞活化标志物—a平滑肌肌动蛋白(a-Smooth muscle actin,α-SMA)、ECM蛋白—纤粘连蛋白(Fibronectin, FN)的表达情况。结果：1、成功建立矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型：病理切片HE染色显示矽尘处理第3天和第7天肺组织内呈现明显的炎症；第14天有炎症细胞浸润的同时伴有间质细胞的增生,肺泡腔进一步缩小；发展至28天时可观察到细胞结节；56天时,肺泡结构破坏严重,肺泡腔塌陷甚至消失,矽结节扩大融合。2、细胞因子芯片筛检结果：筛检的144种细胞因子中,与对照组比较,矽尘处理组至少一组细胞因子表达上调或下调大于等于两倍的有66种,其中信号值较高、变化明显且结合文献报道可能在肺纤维化中有意义的细胞因子有(1)MMPs家族中MMP-3、MMP-9 (Pro)以及其内源性组织抑制剂(TMP-1),MMP-3随着矽尘处理时间的延长呈逐步升高的趋势,MMP-9 (Pro)与TIMP-1均在矽尘处理第14天升高最显著；(2)白细胞介素家族中白介素1α (IL-1α)及其受体(IL-1αR),在矽尘处理第3天呈显著增高并达高峰；(3)趋化因子家族成员趋化因子-1(CCL11)、巨噬细胞源趋化因子(MDC)、巨噬细胞炎症蛋白(MP-3α)、T细胞表达和分泌的调节因子(RATNES)在矽尘处理组小鼠肺组织中各个观察时间截点表达均增高,且均在第14天显著增高并达到高峰。3、根据细胞因子筛检结果及分析,结合文献报道,对增高的MMP-3蛋白进行进一步的验证。在小鼠肺组织中,Western blot显示矽尘组肺组织内MMP-3表达水平均高于对照组,并有逐渐增高的趋势,同时其底物FN在矽尘处理组中表达增高。此外,在矽尘处理组中表达增高的还有TGF-β1及α-SMA, E-cadherin表达下降。在巨噬细胞模型中观察到,随着Si02粉尘浓度的增高,MMP-3和TGF-β1表达水平也增高,在HBE细胞模型中也观察到同样的变化,同时伴有a-SMA的增高和E-cadherin的降低。在3T3细胞模型中,给予外源性TGF-β1处理,细胞中MMP-3及FN的表达皆增高。4、MMP-3可能通过激活TGF-β1促进肺纤维化的进展：在HBE细胞模型中,下调MMP-3可减弱Si02处理引起的TGF-β1和α-SMA的增高,同时也降低FN的表达水平。但在TGF-β1处理的3T3细胞模型中,干涉MMP-3的表达后,FN增高更明显,提示MMP-3可以降解FN,同时又可通过激活TGF-β1促进上皮细胞间质转化(EMT)。结论：多种细胞因子参与矽尘诱导的肺纤维化的发生发展,其中,IL-1α及其受体可能主要在矽尘引起的肺组织炎症反应过程中发挥调节作用,趋化因子可能参与调节纤维化的形成过程,MMP-3可能通过激活TGF-β1促进EMT,同时EMT又进一步促进ECM蛋白的合成,从而导致MMP-3再度增加,形成正反馈回路持续影响肺纤维化发展。