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目的:阐述中药复方双黄连解热、抗炎的药效物质基础。
方法:双黄连方中黄芩的提取提纯方法较成熟,其提取物中黄芩苷的含量大于90%,故不对黄芩苷的提取工艺进行研究。对双黄连方中的金银花和连翘的提取溶剂,提取方法,提取时间进行研究,设计正交试验,筛选出最佳的提取工艺。分别采用含水乙醇和水作为金银花和连翘的提取溶剂,各设计正交试验,以金银花中的绿原酸和连翘中的连翘苷作为考察指标,将两正交试验筛选出的最佳工艺进行比较,含水乙醇提取液中所含的绿原酸、连翘苷等成分的提取转移率均明显高于用传统工艺的水煎煮提取。在前期金银花、连翘乙醇提取最佳工艺确定的基础上,采用AB-8型大孔吸附树脂对双黄连乙醇提取物净化,从树脂径高比、吸附浓度、吸附流速、洗脱剂浓度等方面对大孔吸附树脂纯化工艺条件进行优化,以总酚、总黄酮的含量为考察指标,筛选最佳的纯化工艺。在金银花、连翘乙醇提取物加入处方量黄芩提取物抗炎解热疗效确切的基础上,以干酵母致大鼠发热为双黄连有效部位解热模型,腹腔注射醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高为双黄连有效部位抗炎模型,比较大孔吸附树脂不同水-乙醇梯度洗脱部位提取物的抗炎、解热作用,筛选出双黄连抗炎、解热的有效部位。乙醇提取物通过大孔吸附树脂,用不同浓度的乙醇洗脱得到4个洗脱部位。比较4个洗脱部位加入处方量黄芩提取物后的抗炎、解热作用。采用高效液相色谱法建立了主要化学成分绿原酸、连翘苷、黄芩苷的含量测定方法,并进行了系统适用性试验(线形、精密度、稳定性、重复性、回收率及空白试验等),对自制的3批样品进行了含量测定。采用高效液相色谱法建立了双黄连有效部位及其原药材在同一波长下的HPLC指纹图谱,作为控制其质量的定性指标。通过对十批样品的色谱检测和图谱分析,建立了双黄连有效部位的指纹图谱,所得图谱清晰、分离度稳定性良好,可用于双黄连有效部位质量控制。以峰面积较大、分离度好、保留时间适中的、峰稳定的黄芩苷色谱峰为参照峰,以其保留时间和峰面积作为1,分别计算其它各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积,得到双黄连有效部位指纹图谱的相关技术参数,并在此基础上进行了双黄连有效部位与各原药材的成分相关性研究,在260nm检测波长下找出与原药材保留时间及其紫外吸收光谱一致的色谱峰,阐明了有效部位中主要指纹峰的药材来源。并用添加对照品的方法对共有指纹峰进行了化学成分的归属和确定。
结果:双黄连中金银花、连翘的最佳提取工艺为加10倍量80%乙醇,温浸30分钟,回流提取2次,每次1小时,滤过,合并乙醇提取液,减压回收乙醇至无醇味,并继续浓缩至稠膏。最佳纯化工艺为金银花、连翘乙醇提取液减压回收溶剂至无醇味,加蒸馏水稀释成1.5g·ml-1(生药量),树脂柱的径高比为1:10,最大的吸附量与树脂体积比为1:3.3,水洗脱体积为3倍树脂体积,洗脱剂为70%乙醇,用量为4倍树脂体积。双黄连的有效部位为3、4号部位,与原全方双黄连提取物相比的药效无明显差异。结合第二部分对总成分的考察,确定70%乙醇洗脱部位为双黄连解热、抗炎的有效部位。并对有效部位中的指标性成分进行了定量分析。建立了该有效部位的高效液相指纹图谱,在260nm检测波长下,有29个峰为主要共有峰,确定其为共有峰,各共有指纹峰的平均相对保留时间的RSD为0.11%~0.69%,相对峰面积比值的RSD为1.05%~2.60%,可见对于不同批次的供试品而言,各共有指纹峰的相对保留时间及峰面积的比值相差不大,重现性良好。通过添加对照品的方式确认出5个有效成分,分别为:5号峰(绿原酸),6号峰(咖啡酸),14号峰(芦丁),19号峰(连翘苷),23号峰(黄芩苷)。
结论:本课题较好的阐述了复方双黄连抗炎、解热的药效物质基础,所建立的方法稳定,可行,重复性好。