近年来,工业和农业的快速发展使得环境中的重金属污染日趋严重。土壤和水体中过量的重金属不仅影响植物的正常生长,也会通过食物链危害人类的健康。重金属会损害细胞膜结构完整性,抑制细胞的正常分裂活动以及叶绿素、糖和淀粉的合成。在长期的进化过程中,植物形成了各种抵抗重金属毒害的生理机制。植物可以通过根系限制吸收环境中的重金属,也可以通过植物体内的一些有机化合物,如有机酸、氨基酸、植物螯合肽(phytochelations,PCs)和金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)来螯合重金属离子。此外,植物在重金属胁迫下体内会产生过量的活性氧,植物的抗氧化系统可以清除过量的活性氧来维持植物的体内平衡。本论文是以实验室前期筛选到的耐铜水稻品种(No.B1139)和敏铜水稻品种(No.B1195)为实验材料,分析了两个水稻品种在铜胁迫下基因表达水平上的差异,并研究了在重金属胁迫下水稻的谷胱甘肽硫转移酶(glutathione s-transferases,GSTs)和类萌发素蛋白(germin like proteins,GLPs)的基因功能。铜(Cu)是植物体所必需的微量元素,高浓度的铜却会对植物体内基因的表达产生显著的影响。利用生物信息学技术对两个水稻品种(B1139和B1195)在Cu胁迫下的转录组测序数据进行分析,结果显示Cu胁迫分别诱导B1139和B1195根中7331个和9670个基因的差异表达。GO(Gene ontology)富集分析结果显示Cu胁迫下两个水稻品种中共同上调的基因主要与刺激响应、胁迫响应、生物胁迫、分解代谢途径、非生物胁迫响应、内源刺激响应、大分子修饰、次生代谢途径、催化活性、转录调节活性、转录因子活性和结合功能相关,共同下调的基因主要与基因表达、碳水化合物代谢途径、生物合成途径、细胞大分子代谢途径、DNA代谢途径、细胞组成途径、细胞周期、细胞生物合成途径、结构分子活性和RNA结合相关。Cu胁迫显著诱导了两个水稻品种中ROS清除基因、热激蛋白、病程相关蛋白、次生代谢生物合成相关基因、转录因子、Cu代谢途径相关蛋白、可变剪接和长链非编码RNAs等表达量的变化。剪接因子具有调节细胞内的可变剪接事件的功能,剪接因子可以引导剪接体至基因特定的剪接位点。本研究结果显示Cu分别诱导了水稻B1139和B1195中4个和9个剪接因子的差异表达。通过转录组分析比较水稻B1139与B1195间的基因表达量,两个水稻品种在正常的木村营养液培养条件下仅有711个差异表达基因,而在Cu胁迫下有4766个差异表达基因。GO富集分析结果显示表达量在水稻B1195显著高于B1139的基因主要与胁迫响应有关。谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)是普遍存在于动物和植物体内的酶蛋白,其作用是催化某些内源性或外来有害物质的亲电子基团与还原型谷胱甘肽的巯基偶联,增加其疏水性使其易于穿越细胞膜,并在被分解后排出体外,从而达到解毒的目的。转录组测序结果显示8 μM Cu胁迫下水稻B1139与B1195间有20个GSTs基因的表达量出现显著差异。两个水稻品种体内的GST活性均在Cu胁迫下显著降低,并且B1195品种的GST酶活性降低幅度高于B1139品种。通过分析水稻RGAP(Rice Genome Annotation Project)数据库中GSTs基因表达谱数据以及转录组测序结果中基因的FPKM(Fragments Per Kilobase Million)值,结果均显示水稻OsGSTF2在GSTs基因家族中表达量最高。在正常LB培养液中,野生型大肠杆菌和异源表达OsGSTF2的大肠杆菌生长情况趋于一致,而Cu胁迫下含有OsGSTF2蛋白质的大肠杆菌的耐铜性显著高于野生型大肠杆菌。His-OsGSTF2蛋白被Ni-IDA柱纯化,其体外的GST活性显著受到了铜离子的抑制。进一步,对OsGSTF2蛋白构建三维模型进行分析,结果显示OsGSTF2蛋白中有14个氨基酸可能与其GST酶的活性有关。OsGSTF2蛋白作为一个Cu结合蛋白具有2个推测的Cu结合结构域,H-(X)4-H和C-(X)3-H。OsGSTF2蛋白中41号的组氨酸被推测为Cu结合位点和酶活位点,将41号组氨酸(H)突变为甘氨酸(G),结果显示OsGSTF2H41G蛋白的GST活性显著低于天然的OsGSTF2蛋白。水稻osgstf2突变体(osgstf2-1和osgstf2-2)比野生型水稻在Cu胁迫下生长受到更多的抑制,而不同水稻材料间的谷胱甘肽含量和Cu离子含量都没有显著差异。类萌发素蛋白(Germin like protein,GLPs)广泛分布在植物体内并调节植物的生长和发育过程。已有研究表明GLPs可能具有超氧化物歧化酶(SOD)、草酸氧化酶(OXO)或多酚氧化酶(PPO)等活性,因此GLPs在植物抵抗生物、非生物胁迫过程中具有重要作用。通过识别类萌发素蛋白的Cupin结构域,水稻和拟南芥中分别被鉴定到43个和32个GLPs蛋白。转录组测序结果显示8 μM Cu胁迫下水稻B1139和B1195间有21个GLPs基因的表达量出现显著差异。NCBI数据库中的数据被用来揭示了GLPs基因在植物不同的发育阶段与不同的生物和非生物胁迫条件下的基因表达谱。GLPs基因的启动子区域内含有许多与胁迫相关的顺式作用元件,如ABA响应元件(ABRE)、厌氧响应元件(ARE)、低温响应元件(LTR)、myb结合位点(MBS)、热激元件(HSE)、胚乳表达元件(GCN4)、富含TC重复元件(TC-RICH)以及WRKY转录因子结合元件(W-BOX)。染色体定位结果显示GLPs主要在水稻染色体中以串联重复形式存在,且串联重复基因间的表达量趋于一致。利用贝叶斯算法构建GLPs基因的系统发育树,研究结果显示GLPs基因可以分成6个分支,不同分支中GLPs的基因结构具有高度相似性。重金属胁迫显著诱导3个GLPs基因(OsGLP4-1、OsGLP8-7和OsGLP8-11)的表达量上调。农杆菌介导带有FLAG或GFP标签的GLPs蛋白(OsGLP4-1、OsGLP8-7和OsGLP8-11)在本氏烟草瞬时表达,免疫印迹、SOD酶活检测以及亚细胞定位实验结果显示,3个GLPs蛋白具有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性,并且均定位在植物的细胞壁。这些结果为进一步研究水稻GLPs的功能提供理论和实验依据。