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背景：结直肠癌是世界上第一常见恶性肿瘤,在许多发达国家结直肠癌的死亡率位于所有恶性肿瘤死亡率的第二位。肿瘤侵袭和转移程度是影响预后的主要因素,也是导致患者死亡的主要原因。肿瘤的侵袭转移涉及肿瘤细胞与宿主两方面多步骤的复杂过程,包括肿瘤细胞彼此分离,与基质成分粘连,细胞外基质降解以及肿瘤细胞的移动。粘附在肿瘤细胞侵袭和转移过程中起双重作用：一方面肿瘤细胞必须先从其原发灶的粘附部位脱离,故粘附可抑制侵袭；另一方面,肿瘤细胞从连续的粘附和去粘附中获得运动的牵引力,正是借助这种牵引力肿瘤细胞才能够进行移动。细胞粘附分子(celluar adhesion molecules, CAMs)是细胞膜上的一类跨膜糖蛋白,能够介导肿瘤细胞与细胞外基质、血管内皮细胞及实质器官组织细胞或与其他肿瘤细胞之间的相互作用,与肿瘤的侵袭转移关系密切。Li-cadherin即肝肠钙粘连蛋白,是钙依赖粘附素家族中的一员,最初发现在大鼠的肝细胞和肠上皮细胞上表达,所以被命名为肝肠钙粘连蛋白。已有相关研究表明,Li-cadherin的表达水平与多种消化道肿瘤侵袭转移密切相关。然而,Li-cadherin在消化道中肿瘤侵袭转移过程中的作用是什么?其影响侵袭转移的相关机制是什么?仍有待于进一步研究。目的：构建Li-cadherin siRNA表达载体并稳定转染进入人结肠癌LoVo细胞,建立Li-cadherin“敲弱”的细胞模型,在此基础之上,探讨Li-cadherin siRNA对人结肠癌LoVo细胞侵袭转移能力的影响,为结肠癌的基因治疗提供了新的靶点。方法：1.体外构建Li-cadherin siRNA表达载体pU6-Li-cadherin-shRNA。2.将pU6-Li-cadherin-shRNA和阴性对照表达载体pU6-control-shRNA分别转染入人结肠癌LoVo细胞中,经过抗生素G418筛选之后,建立稳定表达pU6-Li-cadherin-shRNA和pU6-control-shRNA稳定细胞株。3.RT-PCR、Western blot分别检测未经处理的LoVo细胞组、阴性对照组(pU6-control-shRNA)和实验组(pU6-Li-cadherin-shRNA) mRNA和蛋白的表达水平,免疫荧光法定位Li-cadherin在人结肠癌LoVo细胞表达部位。4.体外实验：划痕实验和细胞运动实验检测人结肠癌LoVo细胞运动能力,体外侵袭实验检测细胞的侵袭能力,黏附实验检测细胞异质性黏附能力。5. RT-PCR和明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9的表达和活性变化。结果：1.酶切鉴定和测序的结果证实Li-cadherin siRNA表达载体pU6-Li-cadherin-shRNA构建成功。2. pU6-control-shRNA和pU6-Li-cadherin-shRNA稳定转染组LoVo细胞Li-cadherin mRNA表达水平分别为未处理组LoVo细胞的99.89%和43.61%。3.pU6-control-shRNA和pU6-Li-cadherin- shRNA稳定转染组LoVo细胞Li-cadherin蛋白水平的表达分别为未处理组LoVo细胞的99.72%和36.1%。4.免疫荧光结果示：Li-cadherin蛋白表达主要位于细胞膜上(红色荧光),GFP蛋白表达主要位于细胞浆(绿色荧光),重组质粒pU6-Li-cadherin-shRNA转染组荧光明显弱于未经处理组和pU6-control-shRNA转染组。5.划痕实验结果显示与正常组和阴性对照组相比,实验组细胞的迁移距离显著增加(P<0.05),而正常组与阴性对照组之间无显著性差异(P>0.05)。体外细胞迁移实验结果显示正常组与阴性对照组的穿膜细胞数之间无显著性差异(P>0.05),而与正常组和阴性对照组相比,实验组细胞的穿膜细胞数显著增加(P<0.05)。6.体外侵袭实验结果显示正常组与阴性对照组的穿膜细胞数之间无显著性差异(P>0.05),而与正常组和阴性对照组相比,实验组细胞的穿膜细胞数显著增加(P<0.05)。7.体外黏附实验结果显示正常组与阴性对照组的黏附率之间无显著性差异(P>0.05),而与正常组和阴性对照组相比,实验组细胞的细胞黏附率显著增加(P<0.05)。8.未经处理组和pU6-control-shRNA稳定转染组的LoVo细胞MMP-2和MMP-9的mRNA表达水平相似(P>0.05),均较弱,而pU6-Li-cadherin-shRNA转染组的LoVo细胞MMP-2和MMP-9 mRNA表达水平明显增加(P<0.05)。9.明胶酶谱结果示未经处理组和pU6-control-shRNA转染组proMMP-2, proMMP-9及其活性产物的明胶降解带亮度没有显著性差异(P>0.05)。而重组质粒pU6-Li-cadherin-shRNA转染组proMMP-2, proMMP-9及其活性产物activeMMP-2和activeMMP-9明胶降解带亮度明显强于未经处理组和pU6-control-shRNA转染组(P<0.05)。结论：1.本研究成功构建了Li-cadherin-siRNA真核表达载体：pU6-Li-cadherin-shRNA。2. pU6-Li-cadherin-shRNA能有效降低LoVo细胞中的Li-cadherin mRNA和蛋白表达水平,其mRNA和蛋白抑制率分别为43.61%和36.1%。3. pU6-Li-cadherin-shRNA可以促进结肠癌LoVo细胞的迁移能力、侵袭能力和对细胞外基质的异质黏附能力。4. pU6-Li-cadherin-shRNA能够明显增加MMP-2和MMP-9 mRNA的表达和上调MMP-2和MMP-9的表达及其活性。综上所述pU6-Li-cadherin-shRNA可以促进结肠癌LoVo细胞的侵袭转移能力,以Li-cadherin为靶点的基因治疗将有望成为结肠癌治疗的新的途径,具有非常重要的临床应用价值。