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目的:
观察FTY720对淋巴瘤细胞株Raji增殖、凋亡的影响,探讨其可能的作用机制,为临床应用提供理论依据。
方法:
1、细胞培养
将Raji细胞复苏后重悬于含15%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMIl640培养液中,置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。每隔2-3天换液一次,取对数生长期细胞用于实验。
2、CCK-8法检测FTY720对Raji细胞的增殖抑制率
试验分为7组,A:不加药对照组、B:1.25、C:2.5、D:5、E:10、F:20μmol/LFTY720组,G:空白对照组加入200μl无血清培养基,不接种细胞。37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养48h。每孔加入20μlCCK-8试剂,置37℃培养箱中孵育2h,450nm处检测各孔吸光值。
3、AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡率
分别收集不加药对照组、1.25及2.5μmol/LFTY720组处理48小时的细胞,应用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率。
4、用半定量RT-PCR分析细胞内BeL-2及Caspase-3、9mRNA的基因表达水平
分别收集不加药对照组、1.25及2.5μmot/LFTY720组处理48小时的细胞,提取细胞总RNA,反转录得到对应的cDNA,应用RT-PCR分析细胞内BCL-2及Caspase-3、9mRNA的基因表达水平。
结果:
1、CCK-8法检测FTY720对Raji细胞的增殖抑制率结果显示:与对照组相比,不同浓度组FTY720对Raji细胞的生长都有明显的抑制作用,且在1.25-20μmol/L范围内呈剂量依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。
2、FTY720对Raji细胞的细胞周期影响:不同浓度FTY720(0、1.25、2.5μmol/L)作用于Raji细胞48h后,FTY720各处理组G0/G1期细胞比例分别为(58.01±0.09)%、(66.36±0.25)%、(72.76±0.6)%,S期细胞比例分别为(28.17±0.50)%、(21.14±0.12)%、(20.78±0.29)%;G2/M期细胞比例分别为(13.81±0.49)%、(12.50±0.15)%、(6.47±0.55)%。统计学分析显示,随着FTY720浓度的增加,G0/G1期细胞明显增多,S、G2/M期细胞明显减少,细胞阻滞于G0/G1期。
3、FTY720对Raji细胞凋亡的影响:不同浓度FTY720(0、1.25、2.5μmol/L)作用于Raji细胞48h后凋亡细胞明显增多,凋亡率分别为(0.01±0.18)%、(36.56±0.14)%、(54.41±0.83)%,各浓度组间FTY720对细胞凋亡率的影响有显著性差异(P<0.05)。
4、FTY720对Raji细胞Bcl-2mRNA,caspase-3、9mRNA表达的影响:RT-PCR检测结果显示,不同浓度FTY720(0、1.25、2.5μmol/L)作用Raji细胞48h后,Bcl-2mRNA的相对表达量分别为1.00±0.07、0.45±0.08、0.41±0.10。随着FTY720浓度增加,Bcl-2mRNA的相对表达量逐渐降低,差异具有显著性(P<0.01)。Caspase-9mRNA的相对表达量分别为1.00±0.09、2.00±0.11、2.01±0.16。Caspase-3mRNA的相对表达量分别为1.00±0.07、1.77±0.12、1.81±0.09,随着FTY720浓度增加,caspase-3、9mRNA的相对表达量逐渐增高,差异具有显著性(P<0.05)。
结论:
1、FTY720对Raji细胞的生长有明显的抑制作用,呈浓度依赖性。
2、FTY720使Raji细胞阻滞于G0/G1期,抑制Raji细胞的增殖。
3、FTY720使Raji细胞发生凋亡,且凋亡率呈浓度依赖性。
4、FTY720能通过下调Bcl-2mRNA的表达,上调caspase-9mRNA、caspase-3mRNA的表达,促进Raji细胞凋亡。