研究背景：乳腺癌是当代女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率约占女性各种恶性肿瘤的7%~10%，全世界每年约有50万人因此死亡。除了手术治疗，目前乳腺癌的治疗手段主要还包括放疗、化疗、内分泌治疗等。赫赛汀是历史上第一个靶向治疗药物，它主要通过特异性阻断人表皮生长因子受体2信号通路，从而抑制癌细胞的增生，这使得药物治疗乳腺癌的方法取得突破性进展。但是，赫赛汀的应用也存在着许多的不足之处，如适用人群有限、不良反应较多、价格昂贵等。随着肿瘤生物治疗的发展，有效的靶向系统，不仅能够提高药效，同时能够大大降低药物的毒副作用。因此，寻找肿瘤特异性的抗原和以及相应的抗体，对肿瘤的生物治疗具有极其重要的意义。目前肿瘤免疫相关理论均认为在体内存在着肿瘤特异性抗原，能够诱发机体产生针对肿瘤的免疫反应。但是，寻找肿瘤特异性抗原和相应的抗体十分困难。单链抗体是利用基因工程的方法将传统抗体的轻链可变区和重链可变区通过一段核苷酸链拼接而成的重组蛋白，它具有分子量小，免疫原性低，穿透力强，定位迅速，且易于基因工程制备和改造等优点，非常适合肿瘤的靶向治疗。而20世纪90年代出现的噬菌体展示技术则为肿瘤相关单链抗体的发现和制备开创了一条简便、快速的方法。获得高亲和力而特异性的抗体，取决于两个重要的决定因素：抗体库的库容和制备来源，理想的抗体筛选应该出自尽可能大的库容并直接来源于人体，但因为条件所限，多数相关研究较难同时具备这两点。研究目的：本研究拟通过基因工程和噬菌体展示技术构建大库容量的人源性抗乳腺癌噬菌体单链抗体库，以期从中筛选出具有高亲和力和特异性的抗乳腺癌单链抗体，为乳腺癌的诊断及基因靶向治疗提供新的方案。研究方法：1.收集100例乳腺癌患者外周血，分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，反转录为cDNA，通过SOE-PCR等方法扩增出多样性的单链抗体重链和轻链可变区片段并构建单链抗体，将其连接入噬菌体质粒pCANTAB-5E，再电转化入大肠杆菌TG1，构建初级抗乳腺癌单链抗体库；2.以人乳腺癌细胞系MCF-7为靶标，通过多轮淘洗，筛选出具有高亲和力的特异性抗乳腺癌单链抗体，并对其结构序列进行分析；3.通过ELISA和Western blot等方法，鉴定获得的单链抗体的亲和力和特异性，以及蛋白的基本表达情况。研究结果：1.利用基因工程和分子克隆的相关技术，成功构建了库容量约为2.410~8的初级噬菌体单链抗体库，且所获得抗体具有良好的多样性；2.以人乳腺癌细胞系MCF-7为靶标，利用噬菌体展示的方法，通过4轮淘洗，成功构建具有高亲和力的抗乳腺癌单链抗体库，通过酶切、核酸测序及BLAST比对，所得单链抗体基因的轻重链序列分别与人IgG抗体轻重链可变区序列具有高度同源性（＞90%）；3.通过ELISA方法，证实所得抗体对乳腺癌细胞具有良好的亲和力和高度的特异性，IPTG诱导表达及Western blot结果显示，单链抗体在大肠杆菌细胞周质中呈可溶性表达，其分子量约为30kDa，符合理论预测结果。结论：我们的研究主要利用基因工程和噬菌体展示的方法，构建出大容量的人源性抗乳腺癌初级单链抗体库，再淘洗筛选出具有高亲和力和特异性的单链抗体，并通过核酸测序、ELISA、Western blot等方法，对抗体的基本特性进行了鉴定。这些研究结果证明了乳腺癌患者体内确实存在某些特异性的抗原，并诱发机体产生针对肿瘤的特异性抗体，通过大容量人源性抗体库的构建和特异性筛选，我们成功分离出具有高度亲和力和特异性的抗乳腺癌单链抗体，为进一步获得可应用于临床诊断和治疗的乳腺癌靶向性抗体奠定了良好的基础，同时也为肿瘤特异性抗原的寻找提供了材料和方向。