盐生杜氏藻(Dunaliella salina，简称盐藻)是一种迄今为止发现的世界上最耐盐的真核光合生物，可以在0.3％到饱和盐浓度的范围内生长。盐藻是单细胞绿藻，没有细胞壁，生长快，是一种很好的研究盐胁迫和渗透胁迫的模式物种。盐藻是通过在细胞内快速而大量的合成甘油来调节细胞内外的渗透平衡的。本实验室首次从盐藻中克隆到了甘油合成途径上的关键酶基因一3-磷酸甘油脱氢酶的两个同工酶基因GPDHl和GPDH2。为了搞清楚GPDHZ和GPDH2在盐藻细胞里的具体分工，揭示两种同工酶特殊的基因结构与其高效甘油转化效率之间的关系，以及这两个新基因产生的分子机制与盐藻进化之间的关系。本论文研究了GPDHl和GPDH2两种同工酶基因在胁迫条件下的表达与甘油合成动态变化之间的关系，并对3-磷酸甘油脱氢酶同工酶基因进行生物信息分析、大肠杆菌表达、以及重组蛋白的酶活特性研究和基因组结构比较分析。取得的结果如下： 1、克隆获得了盐藻3-磷酸甘油脱氢酶基因GPDHl，通过对盐藻的GPDHl和 GPDH2进行序列分析，发现这两条同工酶都具有两个结构域，即丝氨酸磷 酸化酶(SerB)结构域和3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)结构域，相对于其它 已经报道的植物3-磷酸甘油脱氢酶多出来一个SerB结构域。因此，我们认 为盐藻的GPDHl和GPDH2是两条新基因，它们的SerB结构域具有3-磷酸甘油磷酸化酶的功能，这样GPDHl和GPDH2就能直接催化磷酸二羟丙 酮(DHAP)产生甘油，大大加速了甘油的合成效率。这也可以解释盐藻能 够快速而大量的合成甘油这一特点。 2、通过大肠杆菌表达和纯化，我们验证了具有两个结构域的GPDH2重组蛋白可 以直接催化DHAP产生甘油，从而证明了新基因GPDH2的新功能就是直接催 化DHAP产生甘油。由于GPDHI和GPDH2结构上高度相似，所以我们猜测GPDHI 也可以直接催化DHAP产生甘油。 3、采用real-timc PCR和Northern杂交研究了这两个同工酶基因的表达特性，发现GPDHI受到盐胁迫的诱导，而且也受到氧化胁迫和厌氧胁迫的诱导；而GPDH2受到盐胁迫和厌氧胁迫的诱导，却受到氧化胁迫的抑制。同时我们检测了各种胁迫下盐藻细胞甘油合成的动态变化，发现氧化胁迫和盐胁迫下，盐藻细胞的甘油合成增加的速率几乎一样，说明在氧化胁迫下GPDH2表达的降低几乎不影响甘油的合成效率。和酿酒酵母的GPD1和GPD2相比较，我们认为，盐藻的GPDH1和酵母的GPD1相似，主要负责在有氧情 况下合成甘油；而盐藻的GPDH2和酵母的GPD2相似，主要负责在无氧情况下合成甘油。 4、我们认为盐藻的新基因GPDH1和GPDH2能直接催化DHAP产生甘油是盐藻能快速而大量合成甘油的关键所在，和耐盐密切相关，是盐藻生活在高盐环境下进化的产物，我们通过实验初步探讨了新基因GPDH2产生的分子机制。用GPDH2的SerB结构域作为探针进行SotJthern杂交，D.salina和 D.bardawil都出现了两条很明显的条带；用GPDH2的GPD结构域作为探针 进行Southern杂交，D.salina和D.bardawi都只出现了一条清晰的条带。 在分析GPDH2的基因组结构时，发现SerB结构域相对应的基因组区域存在 内含子。所以我们认为新基因GPDH2产生的分子机制是“基因复制”，即位 于染色体上另一位点的亲本SerB基因通过复制产生一个新的拷贝，这个拷 贝再插入到3-磷酸甘油脱氢酶基因的5’端，从而产生了现在这个结构奇特 的GPDH2新基因；当我们用杜氏藻的淡水藻种D.lateralis和衣藻的基因组 DNA进行Southern杂交是却没有明显的条带产生，说明D.lateralis和衣藻里面没有和GPDH2同源性较高的序列，也说明D.lateralis和D.salina 的亲缘关系较远，还不能用来作为对照研究GPDH2的产生。由于GPDH1和 GPDH2结构上高度相似，所以我们猜测GPDHl产生的分子机制可能也是“基因复制”。