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含硫氨基酸(SAAs)对动物产毛和产奶的质量影响很大,饲料中补充SAAs,可使羊毛生长和羊毛中含硫量均显著增加,提高奶牛产奶量。含硫氨基酸在饲料植物中含量较少,特别是半胱氨酸和蛋氨酸,常成为第一限制性必需氨基酸。培育高含硫氨基酸的牧草品种是当前牧草品质改良的研究热点之一。百脉根(Lotus corniculatus L.)是重要的豆科牧草之一,但含硫氨基酸含量较低。通过分子克隆及遗传转化等方法,将外源高含硫氨基酸蛋白基因转入百脉根,提高牧草蛋白中含硫氨基酸含量具有十分重要的意义。玉米醇溶蛋白(zein)是玉米种子中的主要贮藏蛋白质,在胚乳中以蛋白体的形式存在,可分为α-、β-、γ-和δ-zein等四种主要类型。其中β-、γ-和δ-zein富含甲硫氨酸和半胱氨酸,其具有在反刍动物瘤胃中稳定而在肠中降解的特性,可用于牧草品质的改良。研究表明在转基因植株中含硫氨基酸均有提高,但必须使外源蛋白占到总提取蛋白的1%～5%才具有实际的营养价值。因此,zein在转基因植株的表达量仍有待提高。本试验将玉米γ-zein基因和zeolin基因(γ-zein和菜豆球蛋白的融合基因)与植物表达载体pCAMBIA1302的绿色荧光蛋白(GFP)报告基因融合,构建植物表达载体pCBzeolin和pCBzein。通过叶盘法转化模式植物烟草,分析目的基因的表达,验证植物表达载体pCBzeolin和pCBzein的正确性。利用农杆菌介导法将γ-zein基因和zeolin基因导入百脉根中,对转化再生植株进行分子检测和含硫氨基酸含量检测。研究结果如下:1.用限制性内切酶NcoⅠ和BglⅡ从中间载体pMD18zeolin和pMD18zein上切下zeolin基因(约1600bp)和γ-zein基因(约720bp),将其定向连接在经相同酶切的质粒载体pCAMBIA1302上,构建成植物表达载体pCBzeolin和pCBzein,测序并进行序列的生物信息学分析。2.采用冻融法将pCBzeolin和pCBzein导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404,利用该菌株转化烟草和百脉根。3.通过筛选培养和PCR检测,得到转γ-zein基因和zeolin基因的烟草再生植株。目的蛋白表达分析表明γ-zein基因和zeolin基因以蛋白体方式,不均匀地分布在原生质体中,并验证表达载体pCBzeolin和pCBzein的正确性和可行性。4.经过共培养、筛选分化、再生,得到百脉根抗性植株。对抗性植株进行PCR、RT-PCR和斑点杂交检测表明,γ-zein和zeolin基因已经整合到百脉根基因组中,在核酸水平得到表达。5.含硫氨基酸数据分析表明,转zeolin基因百脉根植株含硫氨基酸含量极显著高于转γ-zein基因百脉根植株和非转基因百脉根植株的含量(P<0.01),但转γ-zein基因植株与非转基因植株间差异不显著。