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周围神经损伤是临床上常见的疾病,常由过度牵拉、切割、压迫、火器、电烧伤及放射性烧伤和医源性损伤造成。损伤后如无法给予及时有效的修复,神经突触纤维化将造成神经和肌肉的永久性功能性障碍,对日后的康复及生活造成不良的影响。周围神经由于其特殊的结构和复杂的细胞生理,受到损伤后难以快速有效的自我恢复,临床上即使经过一段时间治疗后,仍存在一定程度的神经功能缺失、神经痛等难以解决的问题,所以周围神经损伤后的修复一直是基础和临床科研的重点和热点。现阶段临床上对于神经损伤的治疗多采用神经直接缝合或自体神经移植、药物保护及促进轴突再生的方法进行治疗,临床结果差强人意。对神经损伤的动物模型进行组织学观察发现,导致周围神经缝合后疗效不佳的原因主要有以下几个方面:(1)神经吻合后断端扭曲;(2)吻合口瘢痕组织的侵入;(3)神经的无效再生(即近端的运动神经纤维长入远端的感觉神经纤维鞘内,或近端的感觉神经纤维长入远端的运动神经纤维鞘内);(4)神经再生速度迟缓,神经肌肉突触纤维化等原因。现阶段无论是采用外膜缝合或者是束膜缝合方法均无法完全避免上述问题。如何使损伤后的周围神经组织及时有效的恢复最佳功能,仍是目前困扰医学工作者的一大难题。组织工程技术(Tissue Engineering)作为一种跨越生命科学和工程科学的交叉学科,近些年来取得了长足的发展和应用。其基本理论是构建一种仿生物的组织工程框架,可以为细胞的生长提供支撑,随着组织和器官的逐步恢复,支架本身的材料可以通过自身的降解被自身的组织所代替,其降解的产物可以通过代谢途径转化成对人体无害的分子排出体外。并且,随着人们对这项技术认识的逐步加深,通过在支架上辅以特殊的有针对性的细胞因子,可以有效的加快损伤组织的再生与恢复。同时人们对于利用这项技术修复周围神经损伤提出了许多先进的观点。理想的神经修复鞘管应具有以下的结构和组成:a支架材料要有仿生物学设计,可以提供良好的力学性能和可塑性,同时,管壁应表现为半透膜性质,以保证营养物质的交换和组织再生代谢产物的排出,同时可以阻止纤维瘢痕的长入;b加入神经营养因子,并能有效控制其释放;c鞘管降解的时间应能充分满足神经生长所需要的时间,否则未等神经完全恢复,鞘管已经降解,起不到相应的保护作用。本研究首次尝试通过静电纺丝技术构建了以聚乳酸-羟基乙酸共聚物/壳聚糖为主体的复合了他克莫司(Tacrolimus,FK506)以及Netrin-1因子的轴突导向神经鞘管。为了达到上述要求,本试验进行了下述方面的研究:(1)利用微流控技术构建高通量药物筛选芯片,明确局部使用FK506以及Netrin-1神经轴突导向因子的最佳浓度。(2)壳聚糖复合FK506及Netrin-1神经鞘管的制备与性能修饰。(3)检测神经鞘管的理化性质以及生物安全性。实验一使用微流控芯片筛选局部应用FK506及Netrin-1的最佳有效浓度的研究目的:设计并制作微流控芯片,筛选局部应用FK506及Netrin-1的最佳有效浓度。方法:基于雷诺效应原理,设计出包含浓度梯度生成器以及细胞培养室的微流控芯片,利用荧光成像验证芯片在细胞水平筛查药物对神经再生作用的能力。分离培养、扩增大鼠的雪旺细胞以及背根神经元细胞,将细胞接种于芯片后,使用CCK-8试剂盒检测雪旺细胞增殖水平,同时测量背根神经节细胞轴突生长长度。通过液相质谱色谱分析药物的有效浓度。并于96孔板中重复不同浓度下的细胞增殖实验,检测微流控芯片结果的可靠性。结果:成功构建了微流控芯片,通过荧光强度验证了芯片生成浓度梯度的可靠性。利用芯片获得FK506局部最佳浓度为1.786±0.014ng/ml;Netrin-1最佳局部浓度为51.42±0.14ng/ml。结论:1.制作的微流控芯片可以有效形成药物的作用浓度梯度;2.筛选出FK506神经细胞培养最佳浓度为1.786±0.014ng/ml;Netrin-1最佳浓度为51.42±0.14ng/ml。实验二静电纺丝技术构建聚乳酸-羟基乙酸共聚物/壳聚糖复合他克莫司及Netrin-1轴突导向神经鞘管的研究目的:1.构建单电场双喷头静电纺丝设备。2.制备FK506及Netrin-1轴突导向神经鞘管。3.对鞘管的结构以及基本理化性质进行评估。方法:按照实验要求搭建静电纺丝设备,并对设备进行改造,使其可以满足双喷头共纺的需求。使用单电场双喷头技术,对聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid),PLGA)和壳聚糖/FK506/Netrin-1共混溶液进行共纺,并不断调整各参数配比,获得复合的神经鞘管。对鞘管进行扫描电镜观察,力学机检测鞘管的弹性模量,并对鞘管的基本理化性质做出测定。结果:构建并改良了静电纺丝设备。获得了满足局部最佳浓度的FK506及Netrin-1因子的电纺溶液配比,并制备了轴突导向神经鞘管。神经鞘管具有纳米纤维结构,复合鞘管的PLGA纤维平均直径为197±9.9nm,壳聚糖纤维为105±4.3nm,孔隙率为76.25%,吸水率为11.2%,干燥状态下弹性模量为1.525±0.116,湿润状态下弹性模量为0.819±0.125。鞘管体外降解10周后,质量降解为0.138g,降解率47.26%。FK506以及Netrin-1因子可以在45日内提供最佳有效浓度。结论:构建的单电场双喷头静电纺丝设备符合实验要求。获得了FK506及Netrin-1因子的电纺溶液配比,制备了PLGA/壳聚糖复合FK506及Netrin-1轴突导向神经鞘管。鞘管具有纳米级纤维,良好的亲水性和理化特点。实验三PLGA/壳聚糖复合FK506及Netrin-1轴突导向神经鞘管生物安全性的研究目的:对PLGA/壳聚糖复合FK506及Netrin-1轴突导向神经鞘管生物安全性进行检测和评价。方法:通过大鼠体内注射浸提液、皮下刺激实验、PII测定、溶血试验、细胞增殖实验以及AO-PI染色评价鞘管的体外生物安全性。同时,将PKH26染色的大鼠BMSC/鞘管复合物植入裸鼠体内,利用活体荧光成像系统检测支架在体内降解过程中的生物安全型,并对植入SD大鼠体内的鞘管进行HE染色,评价鞘管周围纤维囊厚度、炎性细胞数量和8周内质量损失。结果:各组实验动物无死亡,全身急性毒性反应阴性,PII为0;溶血率为0.058%,无溶血作用;细胞增殖实验、AO-PI染色、体内植入鞘管及其降解产物均未表现出细胞毒性。鞘管纤维囊厚度以及周围炎症细胞数量随时间降低,且降解周期内炎性细胞及纤维细胞无法透过管壁侵入管腔。结论:采用PLGA/壳聚糖复合FK506及Netrin-1制备的神经修复鞘管以及其降解产物具有良好的生物安全性和组织相容性;鞘管的降解速率可以满足神经修复的要求。