疟疾仍然是严重危害人类身体健康和生命安全的寄生虫疾病。疟原虫抗药性和蚊媒对杀虫剂抗性的出现和扩散使疟疾流行形势进一步恶化。目前疟疾防治迫切需要新的技术、方法和策略。防治技术突破的重要基础是需要对病原体生物学的深刻理解以及病原体与宿主相互作用的功能分子发现和应用。疟原虫生活史复杂，包括了蚊体内发育阶段（蚊期）和脊椎动物体内发育阶段，其中在脊椎动物体内又可分为肝细胞内发育阶段（红外期或肝期）和红细胞内发育阶段（红内期）。疟原虫子孢子经按蚊叮咬进入脊椎动物体内，首先侵入肝实质细胞并在其中进行裂体增殖，产生的裂殖子释放入血并感染红细胞。虽然红内期是疟原虫主要致病阶段，而肝期（红外期）发育不表现明显临床症状，但是肝期是疟原虫在脊椎动物中建立感染的首要阶段。因此，阻断疟原虫对肝细胞的入侵或在其中的生长发育，就可以有效阻断感染，是新型防治技术研发的重要靶点。由于疟原虫红外期研究材料获得的限制，以往疟疾研究大多以红内期原虫为研究对象。近年来，多种新技术的开发和应用使得我们能够对疟原虫肝期发育阶段开展更为深入的研究。疟原虫与宿主相互作用及其细胞和分子机制研究，一直是疟原虫生物学研究领域的重点、热点，也是发展新的药物、疫苗和疟疾防治策略的基础。同样，在肝期疟原虫与宿主相互作用中的关键性因子及其对肝期疟原虫生长发育的作用也是研究的热点。目前，相关研究进展主要集中在发现一些虫源性或宿主来源的分子及其对肝期疟原虫发育繁殖的作用。而现今生命科学研究热点之一的miRNA对疟原虫生长发育的影响只有少量研究报道。miRNA是一类非编码小RNA分子，长度为18-22个核苷酸，主要在转录后水平调节基因功能，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、信号转导、肿瘤发生等过程的调控。新进的报道表明，顶复门原虫可以干预宿主细胞miRNA表达，通过RNAi沉默分子通路，改变宿主细胞内的环境，满足其生长发育的需要或抵抗来自宿主的免疫攻击。疟原虫自身不表达miRNA，有报道显示宿主来源的miRNA对红内期疟原虫感染和致病有影响，但宿主肝细胞miRNA对肝期疟原虫的作用尚未有报道。对此，为研究宿主肝脏细胞miRNA对肝期疟原虫生长发育繁殖的影响，本课题首先采用转基因技术，构建了生活史各阶段稳定表达表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因疟原虫；利用该转基因虫株，建立了疟原虫整个生活史的实验模型。通过子孢子的感染，采用流式分选高纯度阳性肝实质细胞，并以此为材料采用低密度芯片检测并分析了感染肝细胞miRNA表达谱的变化，具体方法和结果如下：1.为了采用流式技术快速分选感染疟原虫的宿主肝细胞，我们构建了生活史各阶段稳定表达GFP的约氏疟原虫（PyGFP）。采用AMAXANucleofactor技术，将线性化的同源重组质粒pL0016转染约氏疟原虫BY265株。该质粒包含有gfp基因、驱动GFP表达的持家基因伯氏疟原虫翻译延长因子1α（pbef1αa）的启动子、用于药物筛选的乙胺嘧啶抗性基因以及伯氏疟原虫ssu-rrna基因。由于伯氏疟原虫与约氏疟原虫的ssu-rrna具有96%同源性，因此质粒与疟原虫基因组可发生同源整合。转染后，经PCR检测发现得到了正确整合的转基因PyGFP虫株和野生虫株的混合群体。采用有限稀释法进行虫株克隆，获得了1个转基因PyGFP的单克隆品系。荧光显微镜检查显示，该单克隆品系原虫发出绿色荧光。通过特异性引物PCR鉴定确认该克隆原虫基因组中发生了正确整合，且无野生虫株的污染。2.建立了转基因PyGFP整个生活史的实验模型。PyGFP接种昆明鼠3天后，斯氏按蚊叮咬小鼠而感染PyGFP。感染后第7天和第16天，解剖蚊胃和唾液腺，观察到发出绿色荧光的胃壁卵囊和唾液腺。再以阳性按蚊叮咬昆明鼠，7天后观察到发出绿色荧光的红内期疟原虫。由此表明已成功建立了转基因PyGFP整个生活史的实验模型，且各期原虫均表达GFP。在此基础上，我们从两方面对该模型进行了优化：（1）优化PyGFP对斯氏按蚊的感染。以不同剂量PyGFP原虫腹腔注射昆明鼠，3天后按蚊叮咬小鼠而感染PyGFP。按蚊感染后第7天,用荧光显微镜计数胃壁卵囊数。结果显示，1×107，5×106和1×106三个剂量组卵囊数无统计学差异，各组50%以上按蚊卵囊数在100-500之间，平均89个；但5×105剂量组，卵囊数平均20个，与以上三组均有统计学差异。小鼠初始转种量以每鼠1×106-1×107个红内期PyGFP原虫为最佳。（2）优化PyGFP子孢子对小鼠肝细胞的感染。为获得高感染效力的子孢子，我们比较了在按蚊感染后不同时间点的子孢子对肝细胞的感染率。将分离的子孢子通过尾静脉注入BALB/c小鼠，40h后制备肝脏单细胞悬液，经流式检测，计算肝细胞感染率。结果显示按蚊感染后第23天分离的子孢子感染效力最强，其宿主肝细胞感染率可达0.083%。3.感染PyGFP肝细胞分选：采用上述优化的蚊期和红外期感染模型，在斯氏按蚊感染后第23天以不连续密度梯度法离心分离唾液腺子孢子，计数子孢子数。300-800万个子孢子经尾静脉注射BALB/c小鼠,即为实验组；正常斯氏按蚊经同样实验处理后，将获得的无子孢子缓冲液尾静脉注射BALB/c小鼠，即为对照组。40h后，用一步胶原酶灌注消化法制备小鼠肝脏单细胞悬液；流式细胞仪分选肝细胞，先在前向角散射（FSC）和侧向角散射（SSC）散点图中圈定肝实质细胞群；再以对照组细胞在前向角散射（FSC）和荧光FITC散点图中的分布，划定正常肝细胞荧光阈值范围；实验组中超出阈值的则为阳性感染细胞。经流式分选每只感染小鼠可获得4000-17000个阳性肝细胞。同时分选对照组肝细胞为对照组4.感染疟原虫肝细胞miRNA表达谱的分析：由于获得感染肝细胞数量少，得到的总RNA量较低，难以满足常用的MicroRNA芯片、RNA-Seq等方法对总RNA量的需求，因此我们选择了敏感性和特异性都较高且对RNA总量需求较少的TaqMANMicroRNA Array低密度芯片，检测miRNA表达谱变化。以感染后40h的BALB/c小鼠肝脏为实验组，检测2个样本；以正常斯氏按蚊经同样实验处理后，将获得的无子孢子缓冲液尾静脉注射BALB/c小鼠，其肝细胞为对照组，检测1个样本。芯片检测获得各组各个miRNA的Ct值，以小鼠snoRNA202为内参，采用2-ΔΔCT法分析结果，经统计学分析，实验组与对照组存在显著性差异。与正常肝细胞相比，感染肝细胞中有29条miRNA差异表达在3倍以上。其中miR-101a、miR-152、miR-21、miR-122、miR-222、miR-92a、miR-29c、miR-142-3p等17条miRNA表达升高在5倍以上。经统计学分析，这些miRNA在实验组与对照组之间有显著性差异。为验证这些改变的miRNA，我们采用SYBR Green Real Time PCR法对其中10条miRNA（miR-152、miR-101a、miR-142-3p、miR-122、miR-222、miR-125a-5p、miR-21、miR-29c、miR-19a、let-7c）进行验证。结果显示：验证结果与芯片检测结果比较，这10条miRNA表达变化趋势基本一致，但倍数变化不完全相同。为探讨差异表达miRNA在疟原虫红前期的作用，我们对差异表达10倍以上的8条miRNA进行生物信息学分析，结果发现，靶基因显著分布于TGF-β信号通路，且涉及多种TGF-β相关分子功能。以往研究发现：TGF-β通过SMAD信号通路上调miR-21表达，抑制细胞凋亡。同时疟原虫有抑制寄生细胞凋亡的生命现象。因此，我们欲从此方向出发开展下一步实验研究。小结：本研究构建了生活史各阶段稳定表达GFP的转基因PyGFP虫株，建立了该虫株感染小鼠→按蚊→小鼠完整的生活史动物模型，通过优化蚊期和红外期感染方法，明显提高了按蚊和宿主肝细胞的感染效率。采用流式技术实现了快速分选感染疟原虫的宿主肝细胞。在此基础上，利用芯片技术检测了感染疟原虫的宿主肝细胞miRNA表达谱变化，发现了17条上调5倍以上的miRNA，并通过了Real time PCR的验证。本研究建立了转基因PyGFP完整生活史的实验模型以及确定了感染疟原虫肝细胞miRNA表达谱，这些为进一步研究宿主miRNA对肝期疟原虫发育繁殖的功能奠定了坚实基础。