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工矿业的迅速发展,以及化肥、农药的大量施用,导致土壤耕作层中铅等重金属含量不断增加。这不仅会影响和限制农作物的生长发育,还会通过食物链危及人类和动物的健康。玉米在全世界范围内广泛种植,是重要的粮食作物,除籽实外,一些地区还将其茎叶作为牲畜的青贮饲料。同时,玉米生物学产量高,有潜力成为新的土壤修复植物。miRNA是一类具有20-24nt序列长度的非蛋白质编码的内源小分子RNA,它们在植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中发挥着重要作用。因此,寻找与重金属胁迫响应相关的重要miRNA,初步揭示由miRNA介导的玉米铅转运及抗性机制显得十分迫切。本研究在课题组前期研究的基础上,以筛选获得的高积累铅玉米自交系178和低积累铅玉米自交系9782为材料,通过基于Solexa原理的深度测序技术和生物信息学方法获得重金属Pb胁迫下玉米根系中表达的miRNA及其靶基因。结合实时荧光定量PCR(Real-time PCR)对与重金属胁迫相关的重要候选miRNA进行表达分析,并采用半定量RT-PCR对其靶基因进行验证,主要结果如下：1.在根系中共检测到92个已知的miRNA和378个新的miRNA。92个已知的miRNA分别属于18个miRNA家族,它们在拟南芥、水稻和玉米等植物上均存在进化上的保守性。378个新的miRNA分别属于185个miRNA家族,其中20个miRNA家族在禾本科植物中存在不同程度的保守性。2.本研究中新发现的6个miRNA (zma-root-miR5, zma-root-miR37, zma-root-miR68, zma-root-miR155, zma-root-miRl 64和zma-root-miRl 84)与目前已知的miRNA169,miRNA164和miRNA171家族在序列上具有相似性,且少于4个碱基的差异。因此推测这6个新的miRNA可能属于这些已知miRNA家族的新成员。3.靶基因预测结果表明,92个已知miRNA的靶基因共靶向54个蛋白,进一步的功能预测发现,这些基因涉及了转录调控、物质能量代谢、电子传递、胁迫响应和信号转导等过程。4.对于新发现的miRNA,共预测得到489个可能的靶基因,其中453个靶基因能够预测其功能,36个靶基因属于未知功能蛋白。这些靶基因大致可分为三类,第一类主要包括一些代谢相关基因,第二类为转录因子,第三大类群是转运蛋白。5.在本研究中,新发现的miRNA还靶向一些阳离子转运子,如ABC转运子、低亲和力阳离子转运子和重金属转移P型ATP酶等。这些基因在植物细胞遭受重金属胁迫后的解毒过程中发挥着重要的作用,因此这些miRNA及其靶基因很可能参与Pb胁迫响应。6.研究还发现了一些与逆境胁迫响应有关的蛋白,如锰超氧化物岐化酶、过氧化物酶前体、磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶等,这些蛋白能够清除由Pb胁迫产生的过多的活性氧(ROS)。7.结合靶基因预测结果,选择了6个与重金属胁迫相关的miRNA进行荧光定量PCR分析。结果表明,178中,48h时的不同Pb胁迫浓度对6个miRNA表达的影响不明显,但在72h时,不同Pb胁迫浓度对178的影响较为明显,且大多有诱导表达的趋势。而在9782中,不同Pb胁迫浓度对48h时miRNA的表达影响较大,且低浓度胁迫对其影响更为明显。8.对植物络合素合成酶、重金属P型转移ATP酶、ABC类转运蛋白和NAC1转录因子等6个候选miRNA的靶基因在178中的表达进行半定量RT-PCR分析。结果表明,6个靶基因在胁迫48h时的表达量明显高于72h时的相应处理,且受Pb浓度影响较小。胁迫72h时,随着Pb胁迫浓度的增加,其表达量均受到明显抑制。结合前面miRNA荧光定量PCR分析结果,表明以上6个候选miRNA对其靶基因的作用方式均为负调控。由此推测,Pb胁迫处理后这些miRNA介导下的靶基因抑制表达可能是导致178高富集Pb的重要原因。