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食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是我国食管癌的主要病理类型。其易发生淋巴结转移,预后较差。细胞凋亡是多细胞生物重要的细胞死亡方式之一,细胞凋亡受阻与肿瘤发生发展密切相关。Caspase-8是半胱氨酸蛋白酶家族的一员,能在外源凋亡信号诱导下被募集形成死亡诱导信号复合物(Death-inducing signaling complex, DISC),进一步活化后启动细胞凋亡。Caspase-8剪切异构体Caspase-8L由于其缺乏C末端催化结构域而保留了完整的N末端死亡效应结构域,在Jurkat等细胞中能竞争性与DISC结合而抑制细胞凋亡。富含嘌呤元件结合蛋白a (Purine-rich element binding protein alpha, PURa)通过直接或间接与DNA结合,调控细胞DNA损伤修复和多种肿瘤相关基因的表达；通过与RNA结合而调控RNA的转运。本研究建立了稳定过表达PURα的食管癌细胞KYSE510-PURα和对照细胞KYSE 510-pCMV6,探讨PURα过表达对食管癌细胞Caspase-8/Caspase-8L等基因表达及其功能的影响。发现过表达PURα促进Caspase-8 L的表达和胞浆定位,而抑制Caspase-8的活化。相反,抑制食管癌细胞PURa表达会促进Caspase-8的活化。Caspase-8L的高表达和胞浆转位抑制Caspase-8酶活性。侵袭和转移是与食管癌预后差密切相关的原因,上皮间叶转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤细胞获得迁移能力的重要生物学特性。对食管癌细胞如何获得EMT表型,进而促进细胞侵袭转移的分子机理知之甚少。通过对稳定过表达PURα的食管癌细胞KYSE 510-PURa及其对照细胞KYSE510-pCMV6的转录组分析,发现多种与细胞粘附相关分子的转录发生明显改变。同时,过表达PURα的食管癌细胞形态呈现纤维样改变。蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光分析发现,过表达PURα的食管癌细胞中E-cadherin表达减少,而N-cadherin、 Vimentin和Snail表达升高。细胞增殖速度加快,细胞运动与侵袭以及划痕愈合能力显著增加,呈现典型的EMT样改变。同时,在宫颈癌HeLa细胞中过表达PURα,也观察到细胞发生同样的EMT表型改变。进一步,对181例食管癌和癌旁组织的免疫组化分析,结果表明食管癌组织中PURα表达显著升高(p<0.001)。PURα表达增高诱导ESCC等肿瘤细胞发生EMT样改变,细胞生长、运动和侵袭迁移能力增强。肿瘤细胞过表达PURα是导致食管癌侵袭转移的重要原因之一。顺铂是食管癌治疗的主要化疗药物之一,能通过与DNA碱基发生交联,抑制肿瘤细胞的DNA复制过程而引起肿瘤细胞死亡。受体相互作用蛋白激酶3 (Receptor interacting protein kinase 3, RIP3)在细胞死亡过程中发挥重要的作用。前期实验发现在食管癌KYSE 140细胞中稳定敲降RIP3后,细胞对顺铂的敏感性降低。定量蛋白质组分析提示RIP3通过DNA损伤修复通路影响食管癌细胞对顺铂的敏感性。然而,RIP3影响细胞对顺铂敏感性的分子机制尚不十分清楚。本研究发现在食管癌KYSE 140细胞中瞬时敲降RIP3,细胞对顺铂的敏感性降低。相反,在食管癌KYSE 140和KYSE510细胞,以及小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryo fibroblast, MEF)过表达RIP3后,增加了细胞对顺铂的敏感性。进一步,通过成簇规律间隔的短回文重复/CRISPR相关基因9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated gene 9, CRISPR/Cas9)技术,在人胚肾HEK293T细胞中构建了RIP3基因稳定敲除细胞HEK293T-RIP3KO。进而在RIP3缺失细胞中重新表达野生型或激酶结构域突变RIP3后,发现过表达野生型和激酶结构域突变的RIP3均增强了细胞对顺铂的敏感性,而且这一功能不依赖于RIP3的激酶活性。蛋白免疫印迹结果显示,在敲除RIP3的HEK293T-RIP3KO细胞中过表达RIP3后,细胞DNA损伤修复通路中CDC37、c-JUN、FOSL1、POLD1、和磷酸化JNK、ERK和AKT等关键分子的表达发生明显改变。RIP3通过影响细胞DNA损伤修复通路而维持细胞对顺铂的敏感性。推测RIP3可能参与DNA错配修复(Mismatch repair, MMR),通过介导DNA损伤应答和诱导细胞凋亡而维持生物体基因组稳定性。DNA错配修复缺陷会使整个基因组不稳定,最终导致肿瘤发生。因此,RIP3有可能作为一种潜在的药物靶标,影响肿瘤细胞对顺铂治疗的敏感性。