雌激素在乳腺癌的形成和发展中起重要作用,外源性雌激素可以增加乳腺癌的患病风险,然而临床结果显示,雌激素替代疗法在增加乳腺癌患病风险中的作用及其预后的关系尚不明确,因而关于雌激素在乳腺癌发生,发展中的作用及生物学机制的研究非常重要。雌激素是一种脂溶性甾体激素,它可以通过激活细胞核内受体(ERa和ERp),影响靶基因转录和翻译过程。这种作用牵涉到新蛋白的合成,需要较长的潜伏期,称为激素的基因组作用(Genomic Actions)。另一方面,雌激素可以作用于细胞膜上的结合位点,介导快速效应,称为激素的非基因组作用(Non-Genomic Actions)。另外也有证据表明,雌激素激活自身受体后,还可以通过与其它受体发生交互作用(crosstalk),影响细胞的增殖和凋亡。ATP曾被认为仅是一种贮能、供能物质,它还是一种细胞间信息传递物质,通过激活P2X(离子通道型受体)和P2Y(G蛋白耦联型受体)而产生广泛的生物学效应。近年来,大量的研究表明P2Y受体存在于各种肿瘤细胞中(乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等),通过激活细胞内信号传导通路,参与肿瘤细胞生长增殖及侵袭转移的调控。在已克隆的P2Y受体中,普遍认为P2Y1, P2Y2,P2Y11在多种肿瘤的发生发展中具有重要作用。早在上世纪80年代,就有学者发现外源性ATP可以抑制肿瘤细胞的生长。乳腺癌细胞自身可以分泌ATP/UTP,乳腺癌细胞中也表达P2Y2受体。该受体活化后可以通过Gq／11激活PLC途径,最终通过诱导内源性Ca2+的释放在细胞的增殖,分化及凋亡中起重要作用。以上结果说明,ATP受体可能在肿瘤的发生和发展中扮演了重要的角色。但乳腺癌细胞表达的P2Y受体是否参与调节乳腺癌的发生发展目前尚不清楚。已有的研究发现,当改变体内雌激素水平时,P2X受体的表达会发生改变,提示雌激素对P2X受体的表达可能存在调控作用。但迄今为止,雌激素是否影响P2Y受体的表达,以及是否可以通过对ATP受体的调节来影响肿瘤细胞的生长分化、增殖凋亡,国内外尚未见报道。因而,本课题以乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231为模型,运用细胞生物学、分子生物学及免疫组织化学等方法,通过体外实验,探讨两种细胞株中ATP受体的类型,P2Y2对细胞增殖的调节作用,以及P2Y2受体参与雌激素对细胞增殖的作用及其中的机制,从而为进一步阐明雌激素对恶性肿瘤的产生和发展的作用的分子机制提供新的线索；为研制新一代的抗癌药物提供实验依据,将对人类预防和治疗肿瘤,降低肿瘤的复发率起到重要作用。一、实验材料和方法：(一)细胞增殖活力的测定采用MTT法测定细胞增殖活力。种于96孔板上的细胞经过加药处理,每孔加10μl MTT培养3-4h,吸去培养基,每孔加入150μl DMSO,低速振荡10min。酶标仪490nm波长测各孔吸光度。(二)免疫荧光细胞化学种于玻片上的细胞去除培养基,用PBS (0.01M, pH7.4)冲洗三次。4%的多聚甲醛固定10min,PBS冲洗三次。分别向不同的玻片上加入用抗体稀释液稀释的羊抗人抗体ERa(1：50),ERp(1：50),湿盒4℃孵育过夜,PBS冲洗三次,每次10min；加抗体稀释液稀释的Cy3标记的驴抗羊IgG抗体(1：100)37℃孵育1h, PBS冲洗三次,每次10min；荧光显微镜观察记录。(三)细胞凋亡率的测定采用流式细胞术测定细胞凋亡率。种于12孔板中(1×105个／孔)的细胞经加药处理后,PBS清洗一遍,0.25%的胰蛋白酶(含1mM EDTA-4Na)消化后,将细胞吹打重悬于1ml PBS中。800转／min离心3分钟,将细胞重悬于100μl annexin V结合缓冲液中。按照Alexa Fluor 488 annexin V/PI试剂盒的说明书对细胞进行annexin V和PI双重染色。混匀避光静置,流式细胞仪测量细胞凋亡。(四)RNA提取和荧光实时定量PCR测定1、细胞总RNA提取和cDNA合成种于12孔板中(1×105个／孔)的细胞经加药处理后,以Trizol提取液提取总RNA,采用紫外分光光度法测定RNA样品纯度(OD260/OD280)。同时进行RNA定量。提取的RNA中,每样本取2μg在25μl体系中反转录为cDNA,-20℃保存,用于实时定量聚合酶联反应扩增P2Y2受体基因。2、荧光实时定量PCR用于扩增P2Y2受体的引物对为TGGCTCGGCGACTGCTAAA(正义),GCATCTCGGGCAAAGCGTA(反义)。反应条件95℃5min,95℃30sec,62.8℃25秒,72℃30秒,40个循环。用于扩增β-actin的基因引物为TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG(正义),GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG(反义)。反应条件95℃5min,95℃30sec,58℃25秒,72℃30秒,40个循环。(五)蛋白印迹杂交分析(Western Blot)预冷RIPA缓冲液裂解细胞标本。分光光度法测定蛋白含量,每孔上样50mg蛋白,经10%浓度的SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至硝酸纤维素膜。经封闭,洗涤后分别在不同膜上加1：800稀释的兔抗人抗体P2Y2(42kD),1：800稀释的鼠抗人抗体β-actin(43kD),4℃过夜。分别加入1：1000稀释耦联辣根过氧化物酶的鼠抗兔抗体和羊抗鼠抗体,室温孵育1h后采用加强化学发光法(ECL)显色,暗室曝光、压片。二、实验结果(一)乳腺癌细胞表达雌激素受体ER(ERα和ERβ)和P2Y2受体RT-PCR结果显示,MCF-7细胞上仅表达P2Y2这一种P2Y受体,MDA-MB-231细胞上亦表达P2Y2受体。免疫荧光化学实验结果显示,MCF-7细胞表达两种ER受体(ERα和ERβ)。MDA-MB-231细胞上不表达ERα受体,仅表达ERβ受体。(二)雌激素通过ERα促进对MCF-7细胞增殖作用1、MTT结果显示,17β-E2 (0.01nmol/L-1μmol/L)作用于MCF-7细胞48小时后,细胞的增殖活力均大于对照组的130%,且各组均与对照组有显著差异。17β-E2对MCF-7细胞的促增殖效应具有时间依赖性。从第36小时开始到96小时,17β-E2均可显著促进MCF-7细胞的增殖,96小时可以达到初始时的486.3±7.88%。17β-E2对MCF-7的促增殖作用可以被ER拮抗剂ICI 182,780阻断。流式细胞术结果显示,17β-E2(0.1nmol/L-1μmol/L)作用于MCF-7细胞系48小时后,与对照组相比,细胞凋亡率均有显著下降。17β-E2对MCF-7的抑凋亡作用可以被ER拮抗剂ICI 182,780阻断。2、MTT结果显示,不同浓度的17β-E2(1 nmol/L-1μmol/L)作用于雌激素非依赖性乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞72小时后,和对照组均无差异(各组P>0.05)。17β-E2与雌激素受体ER拮抗剂ICI 182,780共同作用于细胞72小时后,细胞增殖活力与对照组无差别。3、MTT结果显示,单独加入17β-E2 96小时后,细胞的增殖活力是对照组的163.73±8.41%,与对照组有显著差异。17β-E2对MCF-7细胞的促增殖作用可以被雌激素受体ERα拮抗剂MPP所阻断,而不能被雌激素受体ERβ的拮抗剂PHTPP阻断。(三)P2Y2受体参与雌激素对乳腺癌细胞的促增殖作用1、P2Y2受体激动剂UTP抑制乳腺癌细胞的增殖MTT结果显示,P2Y2受体激动剂UTP(10μmol/L-100μmol/L)作用于MCF-7细胞系96小时,细胞的增殖活力分别为对照组的76.75±7.28%和71.86±11.99%,显著低于对照组。该作用可以被P2Y受体的拮抗剂苏拉明(suramin)所阻断。MTT结果显示,P2Y2受体激动剂UTP(0.1μmol/L-100μmol/L)作用于MDA-MB-231细胞系96小时,细胞的增殖活力从对照组的88.48±2.93%(P<0.05)下降到81.21±5.13%(P<0.01)。该作用可以被P2Y受体的拮抗剂苏拉明(suramin)所阻断。2、P2Y受体拮抗剂促进雌激素诱导的MCF-7细胞的增殖作用MTT结果显示,雌激素17β-E20.1μmol/L单独作用于MCF-7细胞96小时,细胞增殖活力是对照组的163.73±8.41%,而共同加入雌激素和P2Y受体的拮抗剂苏拉明(10μmol/L-100μmol/L),细胞增殖活力为对照组的187.94±22.71%和182.35±22.64%,与单独加入雌激素相比有显著差异(P<0.05)。3、雌激素对乳腺癌细胞P2Y2受体表达的调节作用(1)雌激素通过ERα抑制MCF-7细胞P2Y2受体的表达实时定量RT-PCR和Western Blot结果发现,经不同浓度的17β-E2作用24小时后,在MCF-7细胞中,随着雌激素浓度的增加(1nmol/L-1μmol/L),P2Y2受体mRNA的表达量从对照组的73.79±8.91%(P<0.05)逐渐减少至对照组的53.68±5.9%,P2Y2蛋白的表达量亦显著下降(P<0.01)。17β-E2对MCF-7细胞P2Y2表达的抑制作用可以被雌激素受体拮抗剂ICI182,780阻断。单独给予ERα拮抗剂MPP和和ERβ拮抗剂PHTPP,MCF-7细胞P2Y2 mRNA表达分别为对照的112.64±14.35%和97.44±8.24%,与对照组均无显著差异(P>0.05,P>0.05)。单独给与雌激素时,P2Y2 mRNA表达减少为对照的56.5±6.01%,当同时加入MPP与雌激素时,P2Y2 mRNA表达是对照的84.6±10.73%,与单独给与雌激素组相比显著增加(P<0.01)。当同时加入PHTPP与雌激素时,P2Y2 mRNA表达是对照的61.1±8.30%,,与单独给予雌激素组比较无显著差异(P>0.05)。蛋白表达变化与：mRNA表达变化相一致。(2)雌激素对MDA-MB-231细胞P2Y2 mRNA的表达无影响实时定量RT-PCR结果发现,经不同浓度的17β-E2作用24小时后,在MDA-MB-231细胞系中,随着雌激素浓度的增加(1nmol/L-1μmol/L), P2Y2受体mRNA的表达量与对照组无差异(P>0.05)。当加入雌激素受体ER的拮抗剂ICI182,780时,P2Y2mRNA的表达与对照组和单独加雌激素组相比均无差异.三、结论1.雌激素通过激活ER促进MCF-7细胞的增殖,抑制MCF-7细胞的凋亡,而且雌激素对MCF-7细胞的促增殖作用是通过ERa完成的。2.UTP通过激活P2Y2受体抑制乳腺癌细胞增殖。3.雌激素可以通过ERα抑制MCF-7细胞P2Y2受体的表达,进而促进MCF-7细胞的增殖作用。综上所述,雌激素可能通过作用于雌激素受体ERα,下调P2Y2受体的表达,降低P2Y2受体激活对于乳腺癌细胞的增殖抑制作用,从而发挥其对乳腺癌细胞的促增殖效应,这一作用可能是雌激素促进恶性肿瘤的产生和发展的一条新途径。