本课题拟深入研究ZHX2在非酒精性脂肪肝和肝细胞肝癌发生中的作用及其分子机制，并对其在改善肿瘤化疗耐药性中的作用进行探讨。　　第一部分 ZHX2调控脂蛋白脂酶参与脂肪肝及肝细胞肝癌的作用及机制　　一、ZHX2在多种肝癌细胞系中显著抑制LPL表达　　为明确ZHX2对LPL表达的调控作用，分别进行ZHX2过表达及siRNA干扰实验。利用脂质体在ZHX2本底表达低的细胞系HepG2、BEL7402、HEK293中转染ZHX2过表达质粒pcDNA3.0-ZHX2-HA，pcDNA3.0空载体为对照;在ZHX2本底表达高的细胞系SMMC7721、QSG7701细胞系中转染ZHX2siRNA, negtive control为对照。　　二、ZHX2通过Octamer位点负性调控LPL启动子活性　　1.ZHX2显著抑制LPL启动子活性　　首先构建LPL全长启动子报告质粒pGL3-LPLp(-1678～+67)，分别与ZHX2过表达载体共转染HepG2细胞和CHO细胞，与ZHX2 siRNA共转染SMMC7721、QSG7701细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示，ZHX2过表达能明显抑制LPL启动子活性，而干扰ZHX2表达，LPL启动子活性显著升高。　　2.转录起始点上游-96～-38nt是ZHX2抑制LPL启动子的关键片段　　3.ZHX2通过Octamer抑制LPL启动子活性　　根据转录因子结合位点的分布，重新构建截短启动子-52～+67，共转染实验显示ZHX2仍旧对其活性有很好的抑制作用。TFSEARCH软件分析显示，LPL启动子-52～-38之间的重要的转录因子结合位点只有一个，即Octamer。为验证其作用，设计突变引物，利用突变试剂盒将该区域的Octamer位点进行突变，并构建报告质粒pGL3-LPLp-96-Octamer-mutant。　　4.EMSA及ChIP实验显示ZHX2能与LPL启动子Octamer位点结合　　5.Co-IP实验显示ZHX2可以与转录因子Oct-1结合　　ZHX2含有与蛋白相互作用的HD1功能域。为研究ZHX2能否跟与Octamer结合的转录因子Oct-1结合，用pcDNA3.0-ZHX2-HA转染HepG2细胞后，提取细胞总蛋白，进行免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)实验。结果显示，IP抗体ZHX2杂交的蛋白能够与Oct-1结合，说明ZHX2能够与转录因子Oct-1相互结合。　　三、ZHX2通过抑制LPL减轻肝癌细胞系及小鼠肝脏的脂肪变　　LPL是机体水解脂蛋白的限速酶，并介导肝细胞摄取脂蛋白，在多种脂代谢相关疾病中发挥重要作用。ZHX2对LPL的调控作用提示ZHX2参与脂代谢相关疾病，为验证该假说，进行如下实验:　　1.ZHX2通过抑制LPL，减轻脂肪乳诱导的HepG2细胞脂肪变　　(1)脂肪乳诱导HepG2细胞脂肪变模型中ZHX2与LPL表达负相关　　(2) ZHX2抑制脂肪乳诱导的HepG2细胞脂肪沉积，LPL过表达逆转上述过程　　2.ZHX2通过负调控LPL表达抑制小鼠肝脏脂肪变　　(1)脂肪肝小鼠模型肝组织中ZHX2表达显著降低　　为进一步研究ZHX2及LPL在脂肪肝中的可能作用，分别利用胆碱-蛋氨酸缺乏(Methionine-Choline-Deficient，MCD)饮食及高脂饮食(High-fat diet，HFD)诱导小鼠脂肪肝模型。抽提肝组织RNA，RT-PCR检测Afr1（小鼠ZHX2）及LPL的表达。结果显示，不论是哪种方式诱导的小鼠肝脏脂肪变，其肝内Afr1的表达均明显低于正常饮食组，相应的LPL的表达均高于正常饮食组。提示，ZHX2调控LPL参与肝脏脂肪变。　　(2)干扰ZHX2促进小鼠肝脏脂肪变　　为验证ZHX2在体内参与肝脏脂肪变的作用，构建针对Afr1的小干扰慢病毒Lenti-Virus-Afr1-shRNA，以每只小鼠3x10^7 TU慢病毒，10％体重(ml)的量，尾静脉高压注射C57BL/6小鼠，一周后MCD饲喂。每周称体重，两周后处死小鼠，称肝重，肝脏大体拍照，肝匀浆液测TG。肝冰冻切片油红O检测脂质沉积，并用IPP6.0分析脂质沉积面积。肝石蜡切片做HE染色，观察肝损伤。结果显示，MCD成功诱导肝脏脂肪变，且干扰Aff1表达显著加重MCD诱导的肝脏脂肪变。　　(3)过表达LPL逆转ZHX2对MCD诱导小鼠脂肪肝的抑制作用　　四、ZHX2通过下调LPL表达抑制肝癌细胞体内外生长　　文献报道乳腺癌、脂肪肉瘤组织中LPL表达显著增加，并促进乳腺癌细胞生长。为研究LPL在ZHX2抑制HCC生长中的作用，进行如下实验:　　1.肝癌患者癌组织LPL表达明显高于癌旁组织，且ZHX2与LPL表达显著负相关　　收集22例肝细胞肝癌及其对应的癌旁组织标本，提取RNA并逆转录。实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, Q-PCR)检测LPL表达量。结果显示HCC组织的LPL表达量明显高于癌旁(p＜0.05)。　　2.LPL以脂质依赖性方式显著促进HepG2肝癌细胞系的生长　　3.LPL明显改善ZHX2对肝癌细胞的生长抑制作用，该作用依赖于脂质的存在　　4.LPL能够逆转ZHX2对荷瘤小鼠体内H22肝癌细胞生长的抑制作用　　综上，本研究通过一系列体内外实验及临床标本检测，首次阐明ZHX2对LPL转录负调控的分子机制并首次报道LPL在HCC癌组织的异常高表达及其促HCC生长作用。研究表明ZHX2作为一种转录抑制因子，除了已知的对癌基因和周期蛋白的抑制之外，还可通过对脂代谢重要酶LPL的转录抑制，从而抑制肝细胞脂肪沉积，延缓脂肪肝的发生，并通过抑制LPL介导的脂肪摄取及累积抑制HCC生长。　　第二部分 ZHX2通过下调MDR1增强肿瘤细胞的化疗敏感性　　一、ZHX2显著增强不同肿瘤细胞的化疗敏感性　　1.ZHX2表达水平与肿瘤细胞化疗敏感性相关　　本实验首先用肝癌细胞系和肺癌细胞系同时验证化疗药物顺铂(CDDP)对细胞的毒性。结果显示，ZHX2内源性表达高的细胞系(SMMC7721，A549)，CDDP对细胞的抑制率高，提示ZHX2可能会影响肿瘤细胞的化疗敏感性。　　2.ZHX2增强肝癌及肺癌细胞系对顺铂及阿霉素的敏感性　　将不同的细胞系分别转染ZHX2的过表达质粒和siRNA后，加入不同浓度的CDDP和阿霉素(ADM)，24h后，CCK-8检测细胞存活率，并计算半数抑制浓度IC50值。　　3.ZHX2促进CDDP介导的肿瘤细胞凋亡　　为了进一步验证上述结果，选取耐药性较高的细胞系HepG2，过表达ZHX2后，用CDDP(20ug/ml，24h)诱导细胞凋亡。用AnnexinV-PI标记凋亡细胞，流式检测各组细胞凋亡情况。　　二、ZHX2负向调控不同肿瘤细胞系中MDR1表达　　MDR1是与肿瘤多药耐药性密切相关的基因，且其启动子区NF-Y结合位点的存在提示我们此基因极有可能也被ZHX2所调控。　　三、ZHX2显著抑制不同肿瘤细胞中的MDR1药物泵功能　　MDR1又被称为P蛋白，可以以ATP依赖性方式将包括化疗药物在内的多种物质选择性泵出细胞外。为验证ZHX2对MDR1药物泵的抑制作用，分别将pEGFP-N1-ZHX2转染HepG2和SPC-A-1细胞，24h后，加入40ug/ml ADM。作用4h后，DAPI染核。　　四、ZHX2通过影响NF-YA与MDR1启动子相应元件结合抑制MDR1转录　　1.ZHX2剂量依赖性抑制MDR1启动子活性　　ZHX2具有转录抑制活性。为研究ZHX2对MDR1启动子活性的抑制作用，分别将ZHX2过表达载体或ZHX2 siRNAs与MDR1启动子报告基因质粒共转染不同的肿瘤细胞系。　　2.ZHX2以NF-YA依赖性方式抑制MDR1转录活性　　在MDR1野生型启动子报告质粒pGL3-Mp的基础上，构建ATTGG元件突变的MDR1启动子载体pGL3-mMp，并将这两种载体分别与ZHX2过表达载体或pcDNA3.0共转染HepG2细胞，检测ZHX2对启动子活性的影响。　　3.免疫共沉淀实验证实，肿瘤细胞中ZHX2能与NF-YA结合　　为了确认ZHX2与NF-YA的相互作用，将ZHX2过表达载体转染HepG2细胞。48小时后裂解细胞，用NF-YA抗体及同型对照IgG作为IP抗体。免疫沉淀后的蛋白，用ZHX2抗体和NF-YA抗体进行WB。　　4.ZHX2干扰NF-YA与MDR1启动子的结合　　五、肿瘤组织标本检测显示耐药基因MDR1与ZHX2表达存在负相关关系　　综上所述，ZHX2可通过转录负调控MDR1，降低肝癌及肺癌的多药耐药性。ZHX2调控MDR1可能的分子机制是通过与NF-YA相互竞争CCAAT位点而导致MDR1启动子活性的降低。本研究提示ZHX2可增强肿瘤的化疗敏感性，为肿瘤的基因治疗又添有力证据。