论文部分内容阅读
水通道蛋白(Aquaporin，AQP)具有优良的透水性能在生物仿生膜的制备领域有重要的应用，但此类生物仿生膜普遍存在膜强度低和膜完整性差等缺点。因此，如何增强水通道蛋白与膜材料分子之间的结合能力已经成为提高含AQP生物仿生膜完整性和稳定性的技术关键。 本研究拟用非天然氨基酸改造水通道蛋白Z(AQPZ)与水通道蛋白SS9(AQPSS9)蛋白分子，改变其肽链结构。首先定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶tyrosyl-tRNA synthetase(TyrRS)，使其可催化对丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine，pPpa)合成对应的氨酰tRNA。然后利用定点突变技术在AqpZ与AqpSS9基因特定位点中引入终止密码子TAG。在此基础上在大肠杆菌无细胞体系中实现含非天然氨基酸pPpa的AQPZ和AQPSS9的高效表达。通过优化无细胞表达体系中镁离子浓度，含pPpa的AQPZ可溶表达量达到48mg/L。利用信号肽融合表达策略，含pPpa的AQPSS9可溶表达量达到49mg/L，并建立了亲和层析纯化目标蛋白的分离工艺。 将改性后的水通道蛋白装载到1，2-二油酰基磷脂酰胆碱(1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)脂质体中，经停留光谱分析改性AQPZ的水渗透因子Pf值为3.42×10-4m/s，分别是天然AQPZ和DOPC脂质体的2.7和6.8倍;改性的AQPSS9的水渗透因子Pf值为7.46×10-4m/s，分别是天然AQPSS9和DOPC脂质体的5.7和12.1倍，表明非天然氨基酸pPpa的嵌入并没有影响疏通到蛋白的透水功能。 采用静电吸附的方法制备嵌入有水通道蛋白的生物仿生膜，用截留反渗透装置分析仿生膜的水通量和盐截留率。结果显示嵌入改性AQPZ的仿生膜的水通量为19.9L·m-2·h-1和盐截留率达到68.3％，优于天然AQPZ的性能（水通量:18.7L·m-2·h-1，盐截留率:60.7％）。改性AQPSS9嵌入的仿生膜的水通量为14.8L·m-2·h-1和盐截留率达到48.3％，这与天然AQPSS9仿生膜的性能相当。改性水通道蛋白的嵌入使仿生膜的水通量显著提升，接近于基膜的通量，表明非天然氨基酸的嵌入没有影响其透水功能。改性水通道蛋白比天然水通道蛋白在膜上表现更为优异，可能是因为非天然氨基酸的嵌入使水通道蛋白与磷脂的亲和性增强，导致相同的条件下水通道蛋白的嵌入后更稳定。本研究在无细胞表达体系中探索非天然氨基酸基因编入技术，并将非天然氨基酸基因编入技术运用于水通道蛋白的改性，研究结果对制备高稳定水通道蛋白仿生膜具有重要的推动作用。