肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一,国内肺癌的发病率以及死亡率均占城市恶性肿瘤之首,严重威胁着人类的健康。在能够确诊时,有2/3的患者已经处于局部晚期或者远处转移的状态,他们首选的治疗方式只能为化疗、放射治疗。美国食品药品监督管理局批准,多西他赛(Docetaxel,DOC)作为化疗药物可以应用于不能局部切除或者远处转移的原发肺癌患者。但是,该药物的一些副作用严重限制了DOC的临床应用,这些副作用有中性粒细胞减少、骨髓抑制等。这迫使我们寻找减轻该药物副作用的方法:增强药物对肿瘤细胞的靶向性。在基础研究中发现,纳米活性炭作为化疗药物的载体具有降低药物毒性、缓释以及靶向的作用。ACNP作为DOC的载体,吸附DOC在理论上治疗肺癌方面具有更高的应用价值。因此,本实验采用自制ACNP吸附DOC(ACNP-DOC)为实验药物,研究该药物联合放射治疗对体内、体外Lewis肺癌的作用。　　 方法：　　 采用球磨悬浮分级沉降法制备DOC的靶向载体ACNP;通过透射电镜(TEM)以及原子力显微镜(AFM)观察其表征;将一定比例的DOC与ACNP超声混匀,测定不同时间点游离的DOC的量,绘制曲线求得吸附平衡时间;将不同比例的ACNP和DOC混悬液吸附达平衡后,测游离的DOC的量,通过等温吸附公式确定ACNP对DOC的最大吸附量。体外以恒温摇床、透析装置和混合液(无水乙醇:5％葡萄糖=3:13)模拟体内环境对ACNP-DOC的释药性能进行研究。用甲基噻唑蓝(MTT)法观察评价ACNP-DOC、单纯DOC、单纯ACNP对Lewis肺癌细胞的毒性,了解药物对细胞的抑制作用与时间、浓度的关系,并计算最高抑制率时间的IC50值;AFM观察评价ACNP-DOC、单纯DOC、单纯ACNP对Lewis肺癌细胞膜表征影响;TEM观察评价 ACNP-DOC、单纯DOC、单纯ACNP对Lewis肺癌细胞超微结构的影响;应用流式细胞术检测细胞凋亡以及细胞周期,比较ACNP-DOC、单纯DOC、单纯ACNP对Lewis肺癌细胞引起细胞周期和细胞凋亡的不同点;　　 集落形成实验观察0.10μg/mL、0.79μg/mL两种浓度药物联合不同剂量放射线照射后Lewis肺癌细胞克隆增殖能力,实验分组为:对照组、单纯用药组、单纯放射组(照射剂量分别为0、1、2、3、4、6、8、10Gy)、药物作用12h后照射组(照前给药组12h),根据不同治疗组克隆形成率利用单靶多击模型拟合出Lewis细胞存活曲线,计算体外实验该药物不同浓度的放射增敏比(SER);两种药物以不同的梯度浓度腹腔注射小鼠,观测药物对小鼠的急性毒性反应,计算两种药物的半数致死剂量(LD50);通过血常规检测治疗剂量药物对小鼠白细胞数量的影响;　　 C57小鼠左后肢外侧皮下Lewis肺癌肿瘤模型,治疗分组为:空白对照组、单纯放射组(单纯照射6Gy、10Gy、14Gy、18Gy)、单纯用药组(单纯DOC、ACNP-DOC)、用药联合放疗组(药物+照射),治疗后,用电子天平观测小鼠体重,游标卡尺测量肿瘤直径并计算肿瘤体积,观测肿瘤生长延迟时间,拟合剂量-效应曲线,求出体内试验药物不同浓度的放射曾敏比(SER值);取肿瘤组织行常规病理以及TEM观察,并留取影像学图片。　　 结果：　　 球磨悬浮分级沉淀法制备的ACNP粒子呈球形、表面光滑,粒子间分散性好,平均粒径为71±12nm。在1～8mg/L的浓度范围内,单纯DOC的吸光度值D与浓度C的呈直线关系,得到标准曲线方程为:D=0.0045+0.06844C(r=0.99949,P＜0.0001)。在20～25℃时,振荡时间达25min后,ACNP对DOC的吸附可达到平衡。20～25℃时,求得吸附等温式C/X=0.0098+0.00479C(r=0.99838,P＜0.0001),ACNP对DOC的饱和吸附量为:208.8mg/g,即1gACNP吸附208.8mg的DOC可达到平衡。ACNP-DOC30d的累积释放剂量达76.42%,缓释效果明显。MTT实验表明,单纯DOC、ACNP-DOC在0.16～100μg/mL浓度范围内对Lewis肺癌细胞的生长抑制作用具有浓度依赖性,24h抑制率达高峰;ACNP-DOC对Lewis肺痛细胞的生长抑制作用强于单纯DOC,差异具有统计学意义(P＜0.01)。24h ACNP-DOC对Lewis肺癌细胞的半数致死剂量:IC50=0.79μg/mL:0.79μg/mL的DOC、ACNP-DOC引起细胞分泌的粘附物明显减少,造成细胞膜破裂,形成“空洞样”结构,且ACNP-DOC强于DOC。3.95μg/mLACNP对Lewis细胞及细胞器无损伤作用,DOC、ACNP-DOC造成细胞损伤、引起细胞凋亡。3.95μg/mL以及0.79μg/mL ACNP对Lewis肺癌细胞周期没有影响;0.79μg/mL以及0.10μg/mL DOC、ACNP-DOC对Lewis肺癌细胞具有G2/M期阻滞作用,出现一定数量的四倍体细胞,对细胞周期的阻滞作用,浓度之间差异不具有统计学意义(P＞0.05);72h时间点,ACNP-DOC对Lewis肺癌细胞的G2/M期阻滞作用强于单纯DOC,差异具有统计学意义(P＜0.05)。3.95μg/mL ACNP对Lewis肺癌细胞不具有诱导凋亡的作用,0.79μg/mLACNP-DOC对Lewis肺癌细胞诱导凋亡作用强于0.79μg/mL单纯 DOC,差异具有统计学意义(P＜0.01)。体外药物联合照射实验,0.10μg/mLDOC的SER Do、SER Dq、SER SF2分别为1.40、2.22、2.65;0.79μg/mL DOC的SER Do、SERDq、SER SF2分别为1.55、2.86、3.7570.10μg/mL ACNP-DOC的SER Do、SER Dq、SER SF2分别为1.48、2.59、3.33:0.79μg/mL ACNP-DOC的SER Do、SER Dq、SER SF2分别为2.11、3.63、7.5。急性毒性实验,ACNP减轻了DOC对C57小鼠的急性毒性。治疗剂量ACNP-DOC引起小鼠白细胞总数下降程度以及回升程度与单纯DOC相比,差异具有统计学意义(P＜0.05)。体内试验,20mg/kg DOC的SER为1.43。20 mg/kg ACNP-DOC的SER为2.13。体内实验,100 mg/kg ACNP可以进入肿瘤细胞以及细胞器内,未引起损伤反应;20 mg/kgACNP-DOC则能进入细胞及内部,引起病理性变化。　　 结论：　　 本实验通过球磨悬浮分级沉淀法制备的粒径为71±12nm的ACNP,质量可控;在20～25℃时,1gACNP振荡时间25min可以吸附208.8mg的DOC并达到平衡;ACNP-DOC具有明显缓释性能。单纯DOC、ACNP-DOC对Lewis肺癌细胞的生长抑制作用具有浓度依赖性,24h抑制率达高峰;ACNP-DOC对Lewis肺癌细胞的生长抑制作用强于单纯DOC;24h ACNP-DOC对Lewis肺癌细胞的IC50为0.79μ g/mL。单纯ACNP未对Lewis肺癌细胞膜产生破坏作用;单纯DOC、ACNP-DOC引起细胞分泌物减少,造成细胞膜破裂,形成“空洞样”结构,且ACNP-DOC强于DOC。单纯ACNP可以进入Lewis细胞、细胞器,未引起微细结构病理变化;单纯DOC、ACNP-DOC引起细胞微细结构病理变化。单纯ACNP对Lewis肺癌细胞周期没有影响;DOC、ACNP-DOC对Lewis肺癌细胞具有G2/M期阻滞作用,出现四倍体细胞,对细胞周期的阻滞作用没有浓度之间差异;ACNP-DOC对Lewis肺癌细胞的G2/M期阻滞作用强于单纯DOC。单纯ACNP对Lewis肺癌细胞不具有凋亡作用;ACNP-DOC对Lewis肺癌细胞诱导凋亡作用强于单纯DOC。体外集落形成实验,0.79μg/mL ACNP-DOC联合照射,治疗效果明显优于其他治疗组。ACNP-DOC对C57小鼠急性毒性小于单纯DOC。ACNP-DOC对C57小鼠骨髓毒性较单纯DOC明显减轻。实体瘤实验,20 mg/kg DOC的SER为1.43。20 mg/kg ACNP-DOC的SER为2.13;ACNP-DOC联合照射明显优于其他治疗组。100 mg/kg ACNP用于小鼠,ACNP可达到肿瘤组织,并进入细胞内部,且未引起微细结构病理变化;但是,20 mg/kg ACNP-DOC则能进入细胞及内部,并引起病理性变化。