恶性肿瘤发病率逐年提高,每年都有众多的病例被发现,已成为继心脑血管病之后,排第二位的对人类健康威胁严重的疾患。骨肉瘤是恶性肿瘤中极为重要的一员,其在原发骨肿瘤中的发病率仅次于浆细胞骨髓瘤排在第二位,恶性程度高,发现时多数已经转移,失去了手术的最佳时机。骨肉瘤病人即使能够手术,其术后的5年生存率仍然极低,大约只有5%-20%。目前因骨肉瘤本身对放射治疗的不敏感,只能是以大剂量化疗为主,不但副作用大,而且因耐药性的存在,化疗药物很快失去效果,其5年生存率依然不会有所提升。因此在骨肉瘤的治疗上迫切的需要寻找一种除手术、化疗、放射治疗之外的、新的有效的治疗方案。激光从1960年世界上第一台激光器诞生的那一刻起,就不断的改变我们的生活,并逐渐发现其对生物体有着许多独特的作用,如:热效应、机械效益、光化学效应、生物化学效应等等,其中光化学效应、生物化学效应的发现,让激光迅速在生物医学领域得到快速发展,实验发现激光能够通过诱导恶性肿瘤细胞凋亡来达到治疗肿瘤的目的。目前应用激光配合光敏剂治疗恶性肿瘤已经在多个国家开展,如:美国、英国、法国、德国等等十几个国家,我们国家也已经通过批准并将之应用于恶性肿瘤的临床治疗(如:301医院激光肿瘤治疗科),但目前应用的多为He-Ne激光器,体积巨大、价格昂贵,因此应用与推广受到一定的限制,随着小巧、携带方便、价格低廉、适配性好的半导体激光器技术的不断突破,能量密度不断提高、性能更加稳定,其应用的研究也逐渐的开展起来。目前532-nm半导体激光的应用还处于研究阶段,在研究领域也较少提及其对于恶性肿瘤的治疗作用,半导体激光对于人耐药成骨肉瘤细胞株(MDR-MG-63)的研究目前尚未见报道。本实验拟以MDR-MG-63细胞株为研究对象,就其抑制肿瘤细胞生长、诱导耐药成骨肉瘤细胞凋亡的效果及其分子生物学机制等方面进行深入的探索,为更好的应用半导体激光治疗恶性肿瘤尤其是耐药肿瘤细胞方面提供依据,主要研究内容如下:1、体外培养MDR-MG-63细胞,经不同能量密度激光照射后分为:对照组及能量密度30J/cm~2、60J/cm~2、90J/cm~2、120J/cm~2组,MTT法检测MDR-MG-63细胞活性,检测532nm-半导体激光抑制MDR-MG-63细胞增殖抑制的作用;2、倒置显微镜观察不同能量密度照射后细胞形态学变化;Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下检测细胞核的形态,根据细胞核形态学的变化来判断凋亡是否发生,并从直观上定性分析;3、流式细胞仪Annexin-V-PI双染检测MDR-MG-63细胞的凋亡率;4、Western blotting方法检测caspase-8、caspase-9和caspase-3蛋白表达,判断其诱导细胞凋亡的途径;5、流式细胞仪检测不同能量密度(30J/cm~2、60J/cm~2、90J/cm~2、120J/cm~2组)照射MDR-MG-63细胞时,细胞内活性氧含量;6、激光共聚焦显微镜检测固定大剂量激光(能量密度120J/cm-2)照射MDR-MG-63细胞时,不同时间段(0min;30min;60min;90min;120min;150min;180min)细胞内活性氧水平、线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度的变化;7、Western blotting方法检测p53、Bcl-2、Bax等相关凋亡因子的表达。532nm-半导体激光可有效抑制MDR-MG-63细胞增殖,并通过线粒体途径诱导细胞凋亡,诱导凋亡的途径与细胞内ROS升高、线粒体膜电位下降、细胞内游离钙超载有关,三者间相互联系、相互促进,同时凋亡相关蛋白p53升高、Bax/ Bcl-2升高促进细胞凋亡的发生。