胶质细胞瘤是最常见的中枢神经系统的原发性肿瘤,其发病率及死亡率均较高,其起源于成熟的神经胶质细胞或神经干细胞,呈“树根样”广泛的浸润到周围组织,导致手术难以彻底的切除,而且有极高的复发率。病人的存活率取决于肿瘤的类型及肿瘤的恶性程度,根据WHO的标准,胶质瘤的恶性程度分为四个等级(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)。其中,Ⅳ型胶质母细胞瘤(GBM)的致死率最高,5年存活率低于10%,其原因在于手术全切除的难度极大,瘤细胞对放化疗均不敏感。因此,在现代神经外科学界针对胶质瘤的治疗策略还存在巨大的挑战。早在20世纪,科学家就提出胶质瘤是一种分子方面存在缺陷的遗传病,并且推测可以通过分子治疗手段来克服这一难题。目前关于胶质瘤的分子靶向治疗已经引起人们的关注。Cullin 4B(CUL4B) 是Cullin4B-Ring E3 ligase complex(CRL4B)的组成成分之一。Cullin 4B以CRL4B的形式参与到蛋白质的泛素化进程当中,CRL4B在泛素-蛋白酶途径中特异性识别底物,泛素化过程在真核生物体内是信使RNA被转译成蛋白后的重要修饰之一,在体内,蛋白在酶的催化下被泛素化,然后进入蛋白酶体进行降解。泛素化进程在蛋白质合成与分解的动态平衡中发挥着重要的作用,参与到机体的细胞周期,生长发育和生殖等生理活动中。并且大量的研究报道提示CUL4B在DNA甲基化、蛋白分解以及肿瘤发生机制中起着重要的作用。而且相关研究提示我们Cullin4B在脑部的发育中承担着重要角色。但有关CUL4B在人体脑部肿瘤中作用的相关研究较少,包括胶质瘤。所以我们将CUL4B在胶质瘤中的角色及其相关作用分子进行了初步探讨,希望能发现治疗胶质瘤的一个新靶点,为胶质瘤靶向治疗的提供一项新策略。本研究首先表征了CUL4B在胶质瘤病变部分以及癌旁周围脑组织中的表水平情况,然后通过体外实验培养胶质瘤细胞U87和U251细胞株,并用RNA干扰技术(RNAi)成功建立CUL4B的内源性表达降低的胶质瘤母细胞模型,用western blot技术检测慢病毒是否成功转染胶质瘤细胞U87和U251,致CUL4B表达水平降低。除此之外,通过CCK-8细胞增殖实验和结晶紫染色的方法完成了关于CUL4B对细胞生长和细胞集落形成的研究；用流式细胞技术监测到CUL4B对U87、U251细胞周期产生的变化；用Transwell检测方法观察到CUL4B对U87、U251细胞的细胞迁移运动也起到一定作用；在体内试验中,通过接种shRNA感染的U87、U251胶质瘤细胞,模拟CUL4B对体内肿瘤形成的影响,在功能上探究了CUL4B在胶质瘤中的作用.本文同时也研究了下调CUL4B表达对细胞周期和细胞迁移的调控因子的影响。实验一CUL4B在胶质瘤组织与周围脑组织中的表达情况1.1 CUL4B在胶质瘤中及周围脑组织中的表达首先,实验用qPCR的方法测定了15组胶质瘤及周围脑组织中CUL4B的表达,与同组周围正常的脑组织相比,14组的胶质瘤病变组织中CUL4B mRNA的表达升高了了3倍以上。该结果表明CUL4B在胶质瘤组织中高表达,可能与肿瘤的发展有关。实验二CUL4B在胶质瘤中的作用研究2.1通过慢病毒介导的shRNA降低胶质瘤细胞中的CUL4B表达U87和U251细胞分别感染表达shRNA的慢病毒(Lv-shCon和Lv-shCUL4B),4天后通过荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达水平变化。Lv-shCon组和Lv-shCUL4 B组中,80%的细胞表达GFP,表明细胞株中慢病毒感染成功。qPCR和vestern blotting结果显示Lv-shCUL4B中内源性CUL4B表达受到抑制。与未感染对照组相比,Lv-shCUL4B组U87细胞的CUL4B mRNA水平显著下降,约77.4%,U251细胞中下降了77.8%,而在Lv-shCon和Con组间在CUL4B mRNA表达水平上没有出现差别,有统计学意义。免疫印迹实验亦证实两种细胞株中CUL4B mRNA的下调同样表现在蛋白水平上。因此,慢病毒包装的shRNA可显著降低神经胶质母细胞瘤中内源性CUL4B的表达。2.2下调CUL4B表达对胶质瘤细胞生长和集落形成的影响慢病毒感染U87和U251细胞,通过CCK-8的检测评价CUL4B对胶质瘤细胞生长的影响。结果显示：第5天,与对照组相比,L v-shCUL4B细胞生长明显受到抑制,U87细胞降低了63.7%,U251细胞降低了45.5%,上述结果提示降低CUL4B的表达可显著抑制两种细胞U87、U251的生长过程。慢病毒感染后,U87、U251细胞可见集落形成(结晶紫染色),U87细胞,对照组和Lv-shCon组细胞集落数量均值高达150,而在Lv-shCUL4B组集落均数不到30。与此同时,U251细胞,对照组和Lv-shCon组细胞集落均数为200,而Lv-shCUL4B组集落均数不到40。这些结果均显示下调CUL4B的表达可显著降低神经胶质母细胞瘤(U87、U251)细胞集落的形成过程。2.3下调CUL4B表达对胶质瘤细胞周期的影响通过流式细胞技术得到的结果观察U87、U251两种细胞的细胞周期排布,初步探索CUL4B调控细胞增殖的机制,发现处于细胞周期G1期的U87细胞,Con对照组约为50.0%,Lv-shCon对照组约为52.0%,而在Lv-shCUL4B组升高至约82.0%。相反,与Lv-shCon组相比,Lv-shCUL4B组处于S期的U87细胞明显减少,Con对照组、Lv-shCon对照组和Lv-shCUL4B组分别为40.0%、38.0%、10%。与之类似,由于下调CUL4B的表达,处于G1期的U251细胞比例上升,处于S期的比例下降。结果显示下调CUL4B的表达可通过诱导细胞在G1期停滞从而抑制胶质瘤细胞的生长。2.4下调CUL4B表达对胶质瘤细胞迁移的影响Transwell检测试验发现U87、U251两种胶质瘤细胞可以发生迁移运动,Lv-shCUL4B组U87细胞发生迁移的细胞平均数为65,远远少于空白组和Lv-shCon的平均数值,分别为224、210(p<0.01)。下调CUL4B的表达后,U251细胞发生迁移的数量亦明显减少(p<0.01),结果显示,通过下调CUL4B的表达可阻碍神经胶质母细胞瘤细胞的迁移。2.5下调CUL4B表达对胶质瘤细胞皮下肿瘤形成的影响通过接种慢病毒感染的U87、U251细胞,裸鼠种植异体人神经胶质母细胞瘤细胞模拟胶质瘤的模型成功,随着种植细胞瘤的时间发展,各组皮下肿瘤形状慢慢增大,然而与Lv-shCon组对比,Lv-shCUL4B组肿瘤增长速率明显降低。与Lv-shCon组相比,Lv-shCUL4B组U87细胞种植裸鼠肿瘤重量降低57.7%,U251细胞种植裸鼠肿瘤重量下降75.4%(p<0.01),上述体内和体外实验结果进一步显示,下调CUL4B的表达可有效的抑制胶质瘤的生长。2.6下调CUL4B表达对胶质瘤细胞周期和细胞迁移的调控因子的影响Western blot结果显示,与空白对照组和Lv-shCon组相比,Lv-shCUL4B组Cyclin D1和MMP-9表达水平下降,p16(INK4A)和PTEN表达水平升高。结果显示,CUL4B可能是通过调节上述调控蛋白表达量的方式对胶质瘤细胞的生长和代谢起到重要作用。本研究通过实时定量PCR技术检测了胶质母细胞瘤组织中CUL4B呈现高表达状态,研究显示CUL4B参与胶质细胞瘤的发生发展。用慢病毒转染技术成功建立CULB4的内源性表达降低细胞模型,探究CUL4B与胶质瘤细胞增殖,集落形成,细胞周期及皮下肿瘤形成的关系,研究显示CUL4B参与神经胶质细胞瘤的增殖,形成及细胞周期等过程中。结果显示通过表达shRNA的慢病毒下调CUL4B的表达,可显著抑制细胞增生及细胞集落的形成,上述两种细胞系中Cyclin D1表达下调,p16表达上调从而使肿瘤细胞停滞在G1期,与此同时,肿瘤抑制因子PTEN的表达增加。进一步通过胶质瘤种植裸鼠模型发现,CUL4B的丢失可减轻体内肿瘤的形成,而且下调CUL4B的表达可抑制MMP-9的表达,从而阻止肿瘤细胞发生转移。因此下调CUL4B的表达有可能成为靶向治疗胶质瘤的一种新方法,其作用有待于进一步的研究。