目的： 脑钠素(Brainnatriureticpeptide，BNP)是主要由心房和心室肌细胞合成的神经肽类激素，起初为134个氨基酸组成的多肽片段，随后被加工成为108肽的前体(pro-BNP)。pro-BNP被酶裂解成为氨基端76肽(NT-pro-BNP)与具有生物活性的羧基端32肽(BNP-32)。在病理状态下，左心室收缩强度增加或容量负荷压力增大是BNP生成和释放的主要调节因素。 BNP作为一种具有排钠、利尿、舒张血管作用的神经肽类激素，在临床上，有助于评估心室的修复效果、心肌肥厚和收缩强度等。研究已证实了BNP与急、慢性心衰、急性心梗等多种心血管疾病的早期诊断、鉴别诊断、病理分期、预后评价及治疗关系密切。 目前，临床上检测BNP通常运用抗BNP单克隆或多克隆抗体建立起来的免疫学测定方法，如放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)，微粒子酶免疫法(MEIA)，荧光免疫法(FIA)等。但一些方法存在放射性污染，一些方法所需试剂、仪器依靠进口，成本昂贵，限制了其在临床上广泛应用。本研究针对这一问题，运用本实验室的优势条件，拟研究开发一种成本低廉的非竞争法的检测BNP的ELISA试剂盒，改变BNP检测试剂依赖进口的局面，并且具有与进口试剂相比有等同的灵敏度和特异性。期望BNP的检测在基层医疗单位上作为辅助诊断手段得以广泛应用。 方法： 采用基因工程合成的BNP抗原，以夹心ELISA法为检测策略，运用正交设计方法，对各种检测条件如包被抗体的稀释度，检测抗体的稀释度，BNP抗原的稀释度，血清反应时间，酶标抗体反应时间等进行优化分析。在优化的条件基础上以BNP标准品评估试剂盒的线性检测范围，制作质量标准曲线。在确定了所有的条件以后，确定了各种试剂的工作浓度，用我们研制的ELISA检测试剂检测150例临床样本(病例NYHA分级为Ⅰ～Ⅳ级)，同时与罗氏产品的检测效果进行比较，以评价本实验试剂盒的灵敏度和特异性。 结果： 1.经优化和筛选后，建立了定量检测BNP的双抗夹心ELISA系统。 (1)包被浓度及时间：BNP包被单克隆抗体的浓度为50ng/mL，包被条件为4℃湿盒内过夜，37℃反应1h。 (2)封闭：封闭液为3％BSA，封闭时间为37℃反应1.5h。 (3)抗原反应时间：待测样本(BNP抗原反应的时间)采用1:10稀释，37℃反应45min。 (4)酶标抗体反应时间：酶标抗体的使用浓度为100ng/mL，37℃反应1h。 (5)显色反应：采用常规的TMB底物液，100μL/孔，37℃避光反应20min。 (6)终止反应：加入常规终止液50μL/孔，终止反应，静置5min。 2.通过优化的BNP双抗体夹心法检测系统，以BNP标准品为检测对象，确定该系统的检测线性范围为11～1280pg/ml。 3.检测体系的可靠性评价：重复性实验显示批内变异系数为6.32％；批间变异系数为6.12％。批内批间变异系数均小于10％，符合卫生部的临床试剂检测标准。加标回收实验表明加标回收率分别为93.1％、92.4％和89.2％，平均为91.6％，达到了检测试剂的要求。标准曲线结果显示R2=0.9757，说明所建立的定量检测BNP的双抗夹心ELISA系统具有稳定性、可靠性。 4.灵敏度和特异度评价：应用本试剂检测系统检测150例病例和正常人的血浆，并且与罗氏产品比较，新研制的BNP试剂盒灵敏度和特异度分别为89.3％和95.7％，符合率为91.3％，表明我们研究的双抗体夹心ELISA试剂盒具有罗氏产品相近的检测能力。 结论： 本研究建立了BNP双抗体夹心法ELISA检测体系，其检测BNP的线性范围为11～1280pg/ml。与目前临床使用的进口罗氏相比其检测的灵敏度和特异度分别为89.3％、95.7％，符合率为91.3％。证明其检测的灵敏度和特异度与国外同类产品相当，可在3小时左右完成全部检测过程。检测成本相对低廉，能够实现对病人标本的准确检测，如果能够进一步开发应用到临床将有希望取代国外进口同类试剂，而且由于仅需要酶标仪，可以推广到乡镇一级医院。