转基因小鼠的制作为研究基因表达调控、基因整合机制及癌变病理提供了理想的研究模型，为乳腺反应器的研究奠定基础。本试验首先建立稳定的昆明白小鼠原核期胚胎体外培养系统，应用原核注射法将绿色荧光蛋白(GFP)融合基因导入小鼠原核受精卵的雄原核内，重点对早期转基因胚胎发育过程进行观察，监测GFP的表达情况，以期实现在胚胎植入前完成对外源基因整合表达检测，结果表明： 1．比较小鼠原核胚在几种培养液中体外发育状况，分别为M16、CZB和KSOM，其中以KSOM的培养效果最好，囊胚形成率显著高于M16和CZB(85％比14.7％，10.81％，P＜0.01)。在CZB和KSOM添加10％的胎牛血清(FBS)或牛血清白蛋白(BSA)，培养结果显示添加FBS组明显优于BSA组(P＜0.05)，FBS对后期胚胎的发育更为有利。在采用输卵管上皮共培养时，与无共培养系统的结果相比，发育趋向同步，质量较好，胚胎发育率提高，但差异不显著。本试验表明采用添加10％FBS的KSOM培养液，与输卵管上皮共培养，能够有效的支持昆明白小鼠原核期胚胎体外发育。 2．采用程序化冷冻方法，对不同植冰温度下几种冷冻液的结晶变化进行了分析，并比较其对小鼠胚胎的冷冻效果。—5℃植冰时，3种冷冻液PEF、PGF和PEGF只有部分结晶：当植冰温度为—5.5℃时，PEF和PEGF完全结晶时间为10min，PGF在15min未完全结晶；—6℃植冰时，3种冷冻液完全结晶时分别为8，10和10min；—6.5℃植冰后完全结晶时间分别为5，8和5 min。将小鼠胚胎载入上述三种冷冻液，—5.5℃植冰冷冻解冻后囊胚孵化发育率分别为81.7％，68.5％和87.5％，—6℃植冰时发育率分别为80％0，76.5％和90.9％，—6.5℃植冰后的发育率分别为10％，13.3％和38.4％。结果表明，在—5.5或—6℃时植冰、PEGF作为冷冻保护液冷冻保存小鼠胚胎效果较好。 3．在构建GFP融合基因过程中，采用pEGFP-C1型真核表达载体，具有强的启动子CMV，能够实现在适当转录条件就可以调控下目的基因的表达。在设计融合基因时，在bcl-2的转录起始位点前经PCR插入碱基T，保证读码框正确。将bcl-2基因的cDNA片段克隆到载体的MCS，用双酶切得到线性化的片段，可以用于转基因的研究。 4．将表达载体经酶切后，得到大小约为2.3kb的片段，纯化回收并经乙醇沉淀，溶于转基因用TE溶液中，浓度为1～3μg／mL，分装后备用。小鼠原核胚胎分别于AM10：00和PM4：00获得并进行原核注射，在PM4：00时，大部分胚胎可以观察到原核，原核比较清楚，发育结果好于AM10：00时获取的胚胎。另外在上午将小鼠处死后得到的胚胎，其发育率低于另一组，绿色荧光蛋白融合基因在小鼠早期胚胎表达的研究尽管差异不显著。在试验中一般于PM4:00收集胚胎进行显微操作。5.对桑甚期胚胎进行紫外照射，不同照射时间对胚胎的发育影响显著。照射105、加s和405 时，与对照组相比，囊胚发育率分别为85.14%、78.33%、56.67%和88.46%，照射205时 对胚胎影响显著，在照射405时胚胎的发育率极显著降低(P<0.01)。UV对胚胎的照射时间 不超过205为宜。6.原核注射后的胚胎在体外培养，观察在CMV启动下GFP的表达情况。UV下检查，个别2- 细胞就开始表现出绿色荧光，但发现早期表达的胚胎多数不能发育下去。随着培养时间的延 长，表达GFP的胚胎数量增加，以8~16细胞时达到最多。在形成的囊胚中，表达绿色荧光 的占26.5%，与经过原核注射的胚胎相比，占10.6%。说明可以利用原核注射法进行转基因 的研究。7.将发育到桑囊期的胚胎分割，取部分样品用于特异性PCR扩增，片段大小为6。。bp，结合荧 光观察结果，实验表明表达绿色荧光蛋白的胚胎，其PCR扩增反应阳性率为100%，同时说 明外源基因在胚胎发育早期可以表达，绿色荧光蛋白可以作为报告基因来实现对早期基因整 合及表达的监测。8.在胚胎移植中，整胚的妊娠率显著高于半胚(22.09%比12.5%)，可能是在分割中对胚胎造成 损伤引起的。表达荧光的形态正常胚胎在移植后没有得到个体，但在移植后8一10d处死小鼠， 分离子宫后发现有附着点存在，可能是外源基因，特别是bel一2的表达影响胚胎的正常发育生 长。