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本研究通过体外细胞实验，观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)超声提取物对人牙周膜细胞(humanperiodontalligamentcells，hPDLCs)增殖、凋亡的影响，以及凋亡过程中相关蛋白的表达和活化情况;并进一步研究其主要毒力因子牙龈素K(Lys-gingipain，Kgp)对hPDLCs的作用。观察P.gingivalis在牙周炎中的作用，以及在P.gingivalis诱导细胞凋亡作用中Kg1p发挥作用的情况。因此，本文利用P.gingivalis超声提取物和Kgp从以下两个方面进行研究。
实验一:P.gingivalis超声提取物对hPDLCs增殖以及凋亡的影响
1.MTT法检测P.gingivalis超声提取物对hPDLCs的增殖抑制情况
将hPDLCs以1×104/ml的密度接种于96孔板，①加入不同浓度P.gingivalis超声提取物，使其浓度分别为:6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml，培养24h。②加入浓度为25μg/mlP.gingivalis超声提取物培养4、8、12、24、48h。对照组为培养基中不含P.gingivalis超声提取物的正常hPDLCs培养。采用MTT法检测hPDLCs的增殖。结果显示，与对照组相比不同浓度P.gingivalis超声提取物对hPDLCs的增殖抑制作用随着P.gingivalis超声提取物浓度的增加而增强，经方差分析，6.25μg/ml与12.5μg/ml的实验组比较差异无统计学意义，其余各组间差异均有统计学意义(P＜0.05);当P.gingivalis超声提取物浓度为25μg/ml，与对照组相比，在4～48h内，实验组hPDLCs的增殖均受到抑制，经T检验，各实验组与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。
2.流式细胞仪检测细胞凋亡率
将hPDLCs以5×104/ml的密度接种于6孔板，加入不同浓度P.gingivalis超声提取物(12.5、25μg/ml)培养24h、48h。对照组为培养基中不含P.gingivalis超声提取物的正常hPDLCs培养24h、48h。应用流式细胞仪检测凋亡细胞的比率。结果显示:浓度为12.5、25μg/ml的P.gingivalis超声提取物，作用于hPDLCs24h后，与对照组相比hPDLCs凋亡率升高，实验组与对照组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01);浓度为25μg/ml的P.gingivalis超声提取物作用于hPDLCs24h、48h后，与对照组相比，凋亡率升高，经T检验，实验组与对照组比较差异有显著统计学意义(P＜0.01)。
3.Western-blot和caspase-3活性试剂盒检测caspase-3的表达和活化
将hPDLCs以1×106/ml的密度接种于10cm平皿，加入不同浓度P.gingivalis超声提取物(12.5、25μg/ml)。对照组为培养基中不含P.gingivalis超声提取物的hPDLCs正常培养。采用Westem-blot检测不同浓度P.gingivalis超声提取物作用24h、48h时caspase-3的表达情况。结果显示:浓度为12.5μg/ml、25μg/ml的P.gingivalis超声提取物，作用于hPDLCs48h后，caspase-3表达上升，且与P.gingivalis超声提取物浓度有关。浓度为25μg/ml的P.gingivalis超声提取物，作用于hPDLCs24h、48h，与对照组相比，hPDLCs的caspase-3表达增加。
采用caspase-3活性试剂盒检测不同浓度P.gingivalis超声提取物作用12h、24h时caspase-3的活化情况。结果显示浓度为12.5μg/ml、25μg/ml的P.gingivalis超声提取物，作用于hPDLCs24h后，caspase-3活性上升，且与P.gingivalis超声提取物浓度有关，经方差分析，各组间差异有统计学意义。浓度为25μg/ml的P.gingivalis超声提取物，作用于hPDLCs12h、24h，caspase-3的活性随时间增加，经T检验，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
实验二:牙龈素K对hPDLCs增殖以及凋亡的影响
1.MTT法检测Kgp对hPDLCs增殖的影响
将hPDLCs以1×104/ml的密度接种于96孔板①加入不同浓度Kgp，使其浓度分别为:6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml，培养24h。②加入浓度为25μg/mlKgp培养4、8、12、24、48h。对照组为培养基中不含Kgp的正常hPDLCs培养。采用MTT法检测hPDLCs的增殖。结果显示，与对照组相比，不同浓度Kgp对hPDLCs的增殖抑制率随着Kgp浓度的增加而升高，经方差分析，6.25μg/ml的Kgp与对照组差异无统计学意义(P＞0.05)，6.25μg/ml与12.5μg/ml实验组差异无统计学意义(P＞0.05)，其余各组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。当Kgp浓度为25μg/ml，在4～48h内，与对照组相比，经T检验，实验组hPDLCs的增殖均受到抑制，各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.流式细胞仪检测细胞凋亡率
将hPDLCs以5×104/ml的密度接种于6孔板，加入不同浓度Kgp(12.5、25μg/ml)培养24h、48h。对照组为培养基中不含Kgp的hPDLCs正常培养24h、48h。应用流式细胞仪检测凋亡细胞的比率。结果显示:浓度为12.5、25μg/ml的Kgp，分别作用于hPDLCs24h后，与对照组相比，hPDLCs凋亡率升高，经方差分析，实验组与对照组有显著性差异(P＜0.01)。浓度为25μg/ml的Kgp作用于hPDLCs24h、48h后，与对照组相比，凋亡率升高，经T检验，实验组与对照组有显著性差异(P＜0.01)。
3.Western-blot和caspase-3活性试剂盒检测caspase-3表达及活化
将hPDLCs以1×106/ml的密度接种于10cm平皿，加入不同浓度Kgp(12.5、25μg/ml)。对照组为培养基中不含Kgp的hPDLCs正常培养。采用Western-blot检测不同浓度Kgp作用24h、48h时caspase-3的表达情况。结果显示:浓度为12.5μg/ml、25μg/ml的Kgp，作用于hPDLCs48h后，caspase-3表达上升，且与Kgp浓度有关。浓度为25μg/ml的Kgp，作用于hPDLCs24h、48h，与对照组相比，hPDLCs的caspase-3表达增加。
采用Caspase-3活性试剂盒检测不同浓度Kgp作用于hPDLCs12h、24h时caspase-3的活化。结果显示浓度为12.5μg/ml、25μg/ml的Kgp，作用于hPDLCs24h后，caspase-3活性上升，经方差分析，实验组与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)，不同浓度实验组组间差异无统计学意义(P＞0.05)。浓度为25μg/ml的P.gingivalis超声提取物，作用于hPDLCs12h、24h，caspase-3的活性随时间增加，经T检验，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。
本研究结果显示的P.gingivalis超声提取物可抑制体外培养的hPDLCs增殖，促进其凋亡，并且可能通过调节凋亡启动子caspase-3途径诱导hPDLCs凋亡，说明细胞凋亡参与了慢性牙周炎的发病过程，细胞凋亡可能通过caspase依赖型途径，P.gingivalis的毒力因子Kgp在诱导凋亡方面可能发挥了重要作用。