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目的：原发性肝癌是一种严重威胁人类健康的恶性疾病，易于发生肝内播散和远处转移，远期疗效差。因而寻找有效的抗转移新药和新疗法已成为肝癌研究的重要方面。肝癌相关抗原HAb18G是一种高度糖基化的膜蛋白分子，通过本研究中心自己制备的抗人肝癌单克隆抗体HAb18，从肝癌cDNA文库中筛选得到了其cDNA序列，查询Genbank证实其与CD147分子cDNA序列开放读码框架完全一致，与基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN, Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer)、Basigin、Nureothelin等为同一蛋白在不同组织细胞中的表达形式，同属CD147家族。HAb18G具有刺激成纤维细胞产生基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase, MMPs)的功能，可能在肝癌浸润、转移过程中扮演了重要的角色。HAb18G／CD147拮抗肽，是利用HAb18G纯抗原筛选噬菌体随机12肽文库获得的9条与HAb18G高亲和性结合的12肽。本课题的研究目的是：1．研究HAb18G在多种肿瘤细胞及间质细胞上的表达，为深入研究HAb18G的功能，认识其与肿瘤高复发、高转移特性的关系提供依据；2．利 第四军医大学博士学位论文用生物信息学方法对 HAb18G／CD147桔抗肽（AP－l～AP－9）进行理化性质的预测及相似性的比较，为桔抗肽的结构与功能研究提供帮助，同时为进一步研究抬抗肽功能提供思路；3．研究H AhAb18OCDN7 a抗肽与肝癌细胞表面抗原HAb SG亲和性，为下一步研究桔抗肽功能提供依据；4．研究HAb SGCD147 lA抗肽抗肝癌浸润转移作用的体外实验，获得具有体外抗肝癌浸润、转移的桔抗肽；5．研究HAb SG／CD147诱导明胶酶产生的信号转导机制，为全面认识该分子促进肝癌细胞转移的机理提供理论基础。方洁：本实验共分五部分1．HAb SG在多种肿瘤细胞及间质细胞上的表达： I司接免疫荧光法分析HAb SG在肝癌细胞HHCC、SMMC7721和 BEL7402；结肠癌细胞SWll 16；内皮细胞ECV304；成纤维细胞HELF上 的表达。免疫组织化学法分析HAb18G在肝癌细胞HHCC。 SMMC772、HCC9724，HCC9204和 BEL7402及正常肝细胞 QZG上的 表达。流式细胞仪分析HAb SG在肝癌细胞HHCC、SMMC7721、 MHHC97爿和MHHCC97－L上的表达。2．生物信息学方法对HAb 8G／CD147桔抗肽进行理化性质的预测及序列相 似性的比较： 应用EXPASy数据库分析9条桔抗肽（API～AP习）的分子量、等 电点和疏水性等理化性质。利用 BLASTP、PDB ISL和 SCOP等数据库 对9条HAb SG／CD147 i抗肽的氨基酸序列与己知蛋白序列进行相似性 比较。3．HAb SG／CD147 a抗肽与肝癌细胞表面抗原HAbl8G亲和性的研究： 分别在HAb SG／CD147 a抗肽AP刁、AP上、和AP七的N端标记生 物素，用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测定AP、AP－2和AP．6与 第6 页 第四军医大学博士学位论文 HHCC或SMMC7721细胞表面抗原HAbl8G的亲和性；用桔抗肽AP－ l～APg 分别以 0．8 n g／板、4＊ u g／板、20＊ p g／板和 100＊ u g／板，包被 96孔板，室温干燥后加入 HHCC门 10刁，37℃孵育m，结晶紫染 色，检测不同浓度固定化的AP－1～AP－9与HHCC亲和粘附的关系。4．HAb SG／CD147 a抗肽抗肝癌转移作用的体外实验 分别采用7个肿瘤转移体外实验：O）毒性测定实验：MTT法测定AP－ l～AP．9对肝癌细胞（HHCC）的直接毒性；（2）明胶酶谱：分析不同时间 点AP－l～AP－9对基质金属蛋白酶（MMPS）产生及其激活过程的影响； （3）重组细胞基底膜（reconstituted basement membrane）侵袭抑制实验： 测定AP刁～AP习对肝癌细胞（HHCC）侵袭力的的影响，并测定APq对 HHCC侵袭力抑制的剂量依赖关系（6．25 v g／mL 15．63 p g／mL 39刀6 H g／mL 97．53 n imL and 244二 u g／InL）；（4）HHCC与ECM蛋白成分粘附实 验：分析共孵育30min和lh后，AP－l～AP－9对HHCC与细胞外基质蛋白成 分（Matrigel，FN，LN，IV型胶原）的粘附能力的影响，并测定剂量效 应关系O．8 v g／板、4刀 p g／板、20刀 v g／板及 100 p g／板h 6）HHCC与 HELF或HHCC粘附实验：观察共孵育 lh、Zh和 3h后，AP－l～AP－9对 HHCC与成纤维细胞HELF、HHCC与 HHCC和 HELF与 HHCC的粘附能力 的影响；仰 APq～AP习对ECV304生长、侵袭和粘附实验：MTT法测定 AP－l～AP．9对ECV304生长的直接影响；重组细胞基底膜侵袭抑制实验 测定AP－1～AP－9对ECV304侵袭能力的影响；观察共孵育Zh时后，APS对 内皮细胞ECV304与细胞外基质蛋白成分（Matrigel，F’N，LN，IV型胶 原）的粘附能力的影响；O）运动实验：AP－1～AP－9对HHCC运动能力的 影响。5．HAbl8G／CD147诱导明胶酶产生的信号转导机制 第7 页