氯硝柳胺具有杀螺效果好、对人畜毒性低的优点,是WHO唯一推荐可以大面积使用的化学灭螺药物,也是目前我国使用最普遍的化学灭螺药物,在血吸虫病防治进程中发挥了巨大的作用。但在灭螺剂量下,氯硝柳胺对鱼等水生动物具有较强的急性毒性作用,在灭螺过程中,氯硝柳胺可能会流入河流、湖泊等,引起鱼类、虾、螃蟹等的死亡,造成经济损失,影响养殖业的发展,同时也影响血防工作的开展。因此,降低氯硝柳胺对鱼等水生动物的毒性成为目前血防工作迫切需要解决的问题。要解决氯硝柳胺对水生动物的毒性,首先要弄清楚对鱼等水生动物的毒性作用机制和作用靶点,从而为研制和开发对鱼等水生动物毒性低的杀螺药物提供理论依据。在毒性机制研究中,采用活鱼进行研究,不仅周期长、成本高,而且鱼类本身具有对药物的代谢降解作用,导致结果重复性差。利用体外的鱼类细胞培养代替活鱼进行毒理的实验,则药物与细胞直接作用,周期短,成本低。鱼类细胞的均一性好,具有遗传相似性,避免不同体系的影响,重复性好,并且可同时进行多种药物、多种浓度的检测,从而获得确切的毒理机制。因此,本研究选用斑马鱼尾鳍细胞株(AB.9)和非洲绿猴肾细胞株(Vero)2株细胞系替代整体鱼进行毒性研究,研究氯硝柳胺对细胞毒性作用和影响,为阐明氯硝柳胺的毒性机制开拓新的研究途径。一AB.9和Vero细胞株的建立与培养1.1细胞株的建立与培养购买AB.9细胞、Vero细胞,首先检查培养瓶外观,查验细胞,确保细胞生长状况良好,没有污染现象。将AB.9细胞静置于28℃培养箱培养24h,待细胞铺满培养瓶底80%后,可以进行培养、传代、冻存、复苏,待细胞生长至对数生长期时进行毒性实验。显微镜下观察结果显示AB.9细胞在接种4h~6h贴壁,细胞完全伸展,呈不规则形态。将Vero细胞静置于37℃,5%CO2培养箱培养24h。待细胞铺满培养瓶底80%后进行传代、冻存、复苏,待细胞生长至对数生长期时进行毒性实验。显微镜下观察结果显示Vero细胞在接种4h~6h内贴壁,细胞完全伸展,呈不规则形态。AB.9细胞、Vero细胞均未被污染,重新复苏冻存的细胞株生长良好,可在实验室保存、传代,保种成功。1.2细胞生长曲线绘制将细胞接种于96孔板上,采用MTT法跟踪细胞不同时段的OD值,连续对细胞进行计数,绘制AB.9细胞、Vero细胞的细胞生长曲线,推算2株细胞在细胞培养板上的最佳接种条件。结果显示AB.9细胞以3×104个/孔接种于96孔板,0~24h处于休眠期,24h~48h处于对数生长期,随后进入平台期。Vero细胞以3×103个/孔接种于96孔板,0~24h处于休眠期,24h~48h处于对数生长期,随后进入平台期。对数生长期的细胞活力最强,因此AB.9细胞以3×104~6×104个/孔接种于96孔板,或5×105个/孔接种于6孔板,24h~48h加入氯硝柳胺进行检测最合适。Vero细胞以3×103~6×103个/孔接种于96孔板,或5×104个/孔接种于6孔板,24h~48h加入氯硝柳胺进行检测最合适。二氯硝柳胺对AB.9和Vero细胞的毒性测定2.1氯硝柳胺对AB.9细胞毒性观察AB.9活细胞数量为5×105个/孔接种于6孔板,28℃下静置培养24h。配制氯硝柳胺浓度为6.000mg/L、2.000mg/L、0.667mg/L、0.222mg/L、0.070mg/L、0.025mg/L、0.008mg/L的培养基,1%DMSO的无血清RMPI 1640培养基为溶剂对照,无血清的RMPI 1640培养基为阴性对照,新的10%小牛血清的培养基为空白对照。显微镜下观察氯硝柳胺作用AB.9细胞的形态学变化并纪录,测定氯硝柳胺对AB.9的细胞毒性。结果显示氯硝柳胺的培养基培养AB.9细胞24h,随着氯硝柳胺浓度的升高,细胞间隙从紧密逐渐变大,细胞形态变为不规则并逐渐皱缩变成圆形。当氯硝柳胺浓度>2mg/L时,细胞几乎全部变圆,且大部分细胞呈现空泡状,周围可见有细胞碎片。氯硝柳胺对AB.9细胞具有毒性,且随着剂量的增加毒性加强,最大耐受浓度约为2 mg/L。2.2氯硝柳胺对Vero细胞毒性观察Vero活细胞数量为5×104个/孔接种于6孔板,37℃,5%CO2下静置培养24h。将原培养基吸去,PBS清洗3遍。分别添加氯硝柳胺浓度为20.000mg/L、5.000mg/L、1.250mg/L、0.313mg/L、0.078mg/L、0020mg/L、0.010 mg/L的培养基溶液,并以1%DMSO的无血清RMPI 1640培养基为溶剂对照,无血清的RMPI 1640培养基为阴性对照,新的10%小牛血清的培养基为空白对照。显微镜下观察氯硝柳胺作用Vero细胞形态变化并纪录,测定氯硝柳胺对Vero的细胞毒性。结果显示氯硝柳胺的培养基培养Vero细胞24h,与阴性对照相比Vero细胞形态不随氯硝柳胺浓度的改变而变化,表明氯硝柳胺对Vero细胞无明显毒性反应。2.3 MTT法检测氯硝柳胺对AB.9细胞毒性AB.9活细胞数量为5×104个/孔接种于96孔板,重复接种2块96孔板,细胞贴壁后,分别添加氯硝柳胺浓度为6.000mg/L、2.000mg/L、0.667mg/L、0.222mg/L、0.070mg/L、0.025mg/L、0.008 mg/L的培养基,每个浓度设置3个复孔。以1%DMSO的无血清RMPI1640培养基为溶剂对照,无血清的RMPI 1640培养基为阴性对照,新的10%小牛血清的培养基为空白对照。分别静置培养24h和48h,经MTT法处理后酶联免疫检测仪在490 nm波长为测定其光吸收值。不同时间不同浓度的氯硝柳胺作用AB.9细胞,对细胞存活率的影响,得到氯硝柳胺对细胞的毒性剂量-效应关系。MTT法计算细胞的体外存活率的计算公式如下:存活率=用药孔值无药细胞对照孔值×100%。结果显示AB.9细胞经氯硝柳胺的培养基培养,MTT检测到在培养基中氯硝柳胺浓度≤0.070 mg/L时,24h和48h组细胞的存活率高于空白对照组,且随着药物浓度的升高,细胞的增值率增加,促进细胞生长。氯硝柳胺的浓度>0.070 mg/L时,随着药物浓度的升高,与空白对照组细胞相比存活率下降,死亡率升高。将药物浓度与细胞生存率进行曲线拟合,计算得到氯硝柳胺对AB.9细胞24h和48h的IC50值分别为0.485 mg/L和0.358mg/L,R2分别为0.953和0.995。氯硝柳胺对细胞的影响随着浓度的逐渐升高,从刺激生长转变为抑制生长,再转变为引起细胞死亡。氯硝柳胺对细胞产生急性毒性,鱼细胞和鱼的致死阈值浓度接近,因此氯硝柳胺对AB.9细胞的毒性测定,可以作为药物毒性检测的新方法,也为用细胞代替整体生物测定提供了科学依据。2.4 MTT法检测氯硝柳胺对Vero细胞毒性Vero活细胞数量为5×103个/孔接种于96孔板,重复接种2块96孔板,细胞贴壁后,分别添加氯硝柳胺浓度为20.000mg/L、5.000mg/L、1.250mg/L、0.313mg/L、0.078mg/L、0020mg/L、0.010 mg/L的培养基溶液,每个浓度设置3个复孔。以1%DMSO的无血清RMPI 1640培养基为溶剂对照,无血清的RMPI 1640培养基为阴性对照,新的10%小牛血清的培养基为空白对照。分别静置培养24h和48h,经MTT法处理后酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其光吸收值,MTT法计算细胞的体外存活率的计算公式如下:存活率=用药孔值无药细胞对照孔值×100%。结果显示Vero细胞经不同浓度氯硝柳胺的培养基培养24h和48h,MTT法检测得各组与空白对照组的细胞存活率相比无明显差异。Vero细胞在20 mg/L时存活率未发生明显变化,未发现Vero细胞的生长受氯硝柳胺的明显影响。2.5 SRB法检测氯硝柳胺对AB.9细胞毒性AB.9活细胞数量为5×104个/孔接种于96孔板,重复接种2块96孔板,细胞贴壁后,分别添加氯硝柳胺浓度为6.000mg/L、2.000mg/L、0.667mg/L、0.222mg/L、0.070mg/L、0.025mg/L、0.008 mg/L的培养基,每个浓度设置3个复孔。1%DMSO的无血清RMPI1640培养基为溶剂对照,无血清的RMPI 1640培养基为阴性对照,新的10%小牛血清的培养基为空白对照。分别静置培养24h和48h,经SRB法处理,酶联免疫检测仪在波长540 nm处测定其吸光值。不同时间不同浓度的氯硝柳胺作用AB.9细胞,对细胞存活率的影响,得到氯硝柳胺对细胞的毒性剂量-效应关系。计算细胞的体外存活率的计算公式如下:存活率=用药孔值无药细胞对照孔值×100%。结果显示AB.9细胞经氯硝柳胺培养基培养,在培养基中氯硝柳胺浓度≤0.070 mg/L时,24h和48h组细胞的存活率高于空白对照组,且随着药物浓度的升高,细胞的增值率增加,促进细胞生长。氯硝柳胺的浓度>0.070 mg/L时,随着药物浓度的升高,与空白对照组相比,细胞的存活率下降,死亡率升高,抑制细胞生长。将药物浓度与细胞生存率进行曲线拟合,计算得到氯硝柳胺对AB.9细胞24h和48h的IC50值分别为0.298mg/L和0.318 mg/L,R2分别为0.985和0.968。氯硝柳胺对细胞生长的影响,从刺激生长转变为抑制生长,再转变为引起细胞死亡。氯硝柳胺对鱼细胞和鱼的致死阈值浓度接近,为用鱼细胞代替整体动物(鱼)研究氯硝柳胺的细胞毒性机制提供了科学依据。2.6 SRB法检测氯硝柳胺对Vero细胞毒性Vero活细胞数量为5×103个/孔接种于96孔板,重复接种2块96孔板,细胞贴壁后,分别添加氯硝柳胺浓度为20.000mg/L、5.000mg/L、1.250mg/L、0.313mg/L、0.078mg/L、0020mg/L、0.010 mg/L的培养基溶液,每个浓度设置3个复孔。1%DMSO的无血清RMPI1640培养基为溶剂对照,无血清的RMPI 1640培养基为阴性对照,新的10%小牛血清的培养基为空白对照。分别静置培养24h和48h后,经SRB法处理,酶联免疫检测仪在波长540 nm处测定其吸光值。SRB法计算细胞的体外存活率的计算公式如下:存活率=用药孔值无药细胞对照孔值×100%。结果显示Vero细胞经氯硝柳胺培养基培养,SRB法检测各组与空白对照组的细胞存活率无明显差异。在氯硝柳胺浓度为20 mg/L时,Vero细胞存活率未发生明显变化其生长不受氯硝柳胺的明显影响。三氯硝柳胺引起AB.9细胞死亡的机制研究3.1 Annexin V/PI法检测氯硝柳胺对AB.9细胞死亡的影响AB.9的活细胞数量为5×105个/孔,接种于6孔板中,细胞贴壁后,分别添加氯硝柳胺浓度为0.070mg/L、0.200mg/L、0.300mg/L、0.400mg/L、0.500mg/L、0.600mg/L的培养基,1%DMSO的无血清RMPI 1640培养基视为溶剂对照,无血清的1640培养基为阴性对照,新的10%小牛血清的培养基为空白对照。加入凋亡诱导药物的无血清RMPI 1640培养基为阳性对照。28℃下静置培养24 h。Annexin V/PI法处理,流式细胞仪检测Annexin V、PI、Annexin V和PI 3种荧光水平,根据检测数据计算细胞凋亡与坏死率。结果显示AB.9细胞经氯硝柳胺培养基作用24h,当药物浓度>0.070 mg/L时,随着药物浓度的增加,活细胞数量逐渐减少,细胞的坏死率逐渐上升,而凋亡率则没有明显变化。说明氯硝柳胺能引起鱼细胞坏死,并且其在细胞的作用位点可能位于启动细胞坏死的表达通路或线粒体中细胞呼吸链的组成蛋白。3.2 Annexin V/PI法检测氯硝柳胺对Vero细胞死亡的影响Vero的活细胞数量为5×104个/孔,接种于6孔板中。经氯硝柳胺浓度为5 mg/L和20 mg/L分别作用的Vero细胞为实验组。1%DMSO的无血清RMPI 1640培养基为溶剂对照,无血清的RMPI 1640培养基为阴性对照,新的10%小牛血清的培养基为空白对照。加入凋亡诱导药物的无血清RMPI 1640培养基为阳性对照。37℃,5%CO2下静置培养24 h。Annexin V/PI法处理,流式细胞仪检测Annexin V、PI、Annexin V和PI 3种荧光水平,根据检测数据计算细胞凋亡与坏死率。结果显示Vero细胞经氯硝柳胺浓度5 mg/L和20 mg/L的培养基培养,细胞坏死率、凋亡率与阴性对照组相比较无明显差异(P>0.05)。说明氯硝柳胺对Vero细胞死亡方式无明显作用。四氯硝柳胺对AB.9细胞蛋白表达的影响研究不同浓度氯硝柳胺作用AB.9细胞24 h,氯硝柳胺浓度为0.500 mg/L、0.070 mg/L的培养基培养的AB.9细胞为实验组,1%DMSO的无血清RMPI 1640培养基为溶剂对照,无血清的RMPI 1640培养基为阴性对照,新的10%小牛血清的培养基为空白对照。24h后各实验组细胞用裂解液裂解,纯化蛋白质,Brandford法进行定量,确保各组的待检测蛋白含量基本一致。用上样缓冲液溶解蛋白样品,进行第一向等电聚焦电泳(IEF)。IEF结束后,进行第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将凝胶进行考马斯亮蓝染色,通过Gel Doc 2000凝胶成像仪采集图像,利用PDQuest 8.0凝胶分析软件对图像进行分析,筛选出表达有差异的蛋白点。将表达有差异的蛋白切下,提取凝胶上的蛋白进行时间飞行质谱鉴定,同时结合生物信息学进行生物学功能鉴定。利用PDQuest8.0电泳图谱分析软件检测不同浓度氯硝柳胺作用的AB.9细胞蛋白电泳图谱上的蛋白点。每个浓度的蛋白样品进行3次平行电泳,同一种样品蛋白图谱比对显示重复性在77%~100%之间,样品重复性很好,满足各处理组样品间进行差异比较的要求。空白对照组、溶剂对照组、0.070 mg/L、0.500 mg/L分别检测出193±44、115±22、102±18.7、83±25个蛋白点,其中大部分蛋白的分子量处于10KD~120KD分布范围内,蛋白的等电点在5~8之间。AB.9细胞蛋白电泳图谱分别进行两两比较,结果发现氯硝柳胺浓度为0.070 mg/L组,与空白对照相比,有26个差异点,其中有2个蛋白点表达上调,有12个蛋白点只在空白对照中表达,有12个蛋白点只在0.070 mg/L氯硝柳胺作用后表达。在氯硝柳胺浓度为0.500 mg/L组,与空白对照相比,有34个差异点,其中有3个蛋白点表达上调,5个蛋白点表达下调,有13个蛋白点只在空白对照中表达,有13个蛋白点只在0.500 mg/L氯硝柳胺作用后表达。挑选部分差异点进行飞行时间质谱鉴定,成功鉴定得到7个蛋白,为:DNA-dirceted RNA polymeraseⅢsubunit RPC2、ch211-69g19.2 protein、88517 protein、PREDICTED:insulin receptor substrate 2、M-phase phosphoprotein 6、novel protein、fructose-bisphosphate aldolase C-B。经生物功能鉴定7个蛋白分别与信号转导、细胞分裂、细胞生长、细胞内糖酵解途径有关,具体功能和作用有待进一步研究。