研究背景及目的癌/睾丸抗原(cancer/testis antigen,CTA)为肿瘤抗原的一大类。因其高频率且较为严格的在肿瘤组织中表达,并能够诱导机体产生抗肿瘤的特异性体液或细胞免疫应答,CTA在肿瘤免疫治疗中极具发展潜力,逐渐成为肿瘤免疫治疗中的研究热点。睾丸特异性蛋白酶50(testes-specific protease 50,TSP50)基因是利用从人乳腺癌细胞中分离出来的低甲基化DNA片段,通过甲基化敏感的代表性差异分析技术,从人睾丸cDNA文库中筛选发现的一种CTA基因。它编码一种苏氨酸蛋白酶,与常见的丝氨酸蛋白酶同源,但其酶催化活性中心三联体中的丝氨酸被苏氨酸所替换。生理条件下,TSP50特异性表达于睾丸的精母细胞中,病理状态下高水平表达于绝大部分(>90%)乳腺癌组织中。降低TSP50基因表达水平能够抑制肿瘤细胞增殖、集落形成和迁移,诱导细胞凋亡,并增强细胞对多柔比星的敏感性。其中的分子机制可能与NF-κB的激活有关。TSP50基因接受p53基因的负调节,而碱性成纤维细胞生长因子能够通过ERK/Sp1通路下调TSP50的表达。因此,上述结果提示TSP50基因应该是一个癌基因。通过文献检索,目前尚未见在除乳腺癌以外的其它人体恶性肿瘤中发现TSP50异常表达的报道。早期研究认为,TSP50基因的表达与其启动子的甲基化状态密切相关。乳腺、肺、肾等正常组织中的TSP50基因启动子处于甲基化状态,此时基因不表达;相反,睾丸与乳腺癌中的TSP50基因处于去甲基化状态,此时基因表达。与正常结直肠组织相比,结直肠癌普遍存在基因整体的低甲基化状态,并且目前已经发现结直肠癌表达多种CTA。因此,我们推测TSP50也很可能在结直肠癌中表达。迄今,TSP50基因在结直肠癌中的表达情况及其临床意义尚不清楚。本研究目的在于通过检测TSP50在结直肠癌中的表达情况,分析其与各临床病理特征间的关系;以结直肠正常组织与腺瘤作为对照,评价TSP50对结直肠癌的诊断价值;并基于肿瘤分期(早、晚期)评价其对结直肠癌患者的预后价值。此外,我们还检测了p53蛋白与癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)在结直肠癌中的表达,以探讨其与TSP50表达水平之间的关系。由于CEA是一个已经确立的结直肠癌预后因子,我们同时分析了CEA与该组结直肠癌患者预后间的关系,以验证该组患者作为预后研究的可信度。方法1.提取SW480、SW620、LS 174T、HT-29、LoVo、CaCo-2与HCT 116等结直肠癌细胞株的总RNA与蛋白质,分别利用RT-PCR与Western blot检测TSP50的mRNA与蛋白质在上述结直肠癌细胞株中的表达。2.利用Western blot分析比较TSP50在8例结直肠癌患者的癌组织及其癌旁组织中的表达差异。3.收集我院手术切除的结直肠癌组织95例,腺瘤组织20例,正常结直肠组织20例,制成组织芯片,并采用免疫组织化学染色显示TSP50、p53及CEA在组织中的表达情况,观察它们在细胞中的表达部位(细胞核、细胞浆、细胞膜)。根据染色的强弱和/或染色细胞的数量,将TSP50、CEA及p53的表达水平分为:-、+、++、+++四个等级。为便于统计学分析,将“-、+”合并为低表达组,“++、+++”合并为高表达组。4.利用卡方检验评价临床病理特征(患者年龄与性别,肿瘤的部位、大小、浸润深度、淋巴结转移、分期与分级等)与TSP50、p53或CEA表达水平的关系。利用等级资料的相关性分析评价TSP50表达水平与p53或CEA表达水平的关系。5.利用受者作用特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线评价TSP50在结直肠癌与结直肠正常组织或腺瘤中的鉴别诊断价值,并计算敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值以及约登指数(敏感性+特异性-1)等评价指标。6.收集患者从手术之日起至本研究结束时的预后资料,计算患者的5年生存率、中位生存时间。以患者死于结直肠癌作为终末事件,利用Kaplan-Meier生存曲线、对数秩检验(log-rank)及构建多因素Cox模型,评价TSP50、p53、CEA及多种临床病理特征在结直肠癌中的预后价值。结果1. SW480、SW620、LS 174T、HT-29、LoVo、CaCo-2与HCT 116等结直肠癌细胞株均在mRNA与蛋白质两个水平异常高表达TSP50。2. 8例手术切除的结直肠癌组织均异常表达TSP50,而癌旁组织不表达或仅有少量表达。其中7例结直肠癌组织的TSP50表达水平显著高于相应的癌旁组织。3.组织芯片的TSP50免疫组织化学染色结果为:95例结直肠癌组织中高表达者65例(68.4%),20例结直肠腺瘤组织中高表达者3例(15.0%),20例结直肠正常组织中无高表达者。TSP50在结直肠癌组织中的表达显著高于结直肠腺瘤和正常组织(P<0.0001)。TSP50主要表达于细胞浆,但部分结直肠癌中也能见到细胞浆与细胞膜同时表达。4. TSP50在结直肠癌中的表达水平与p53、CEA及患者性别、年龄,肿瘤的部位、大小、浸润深度、淋巴结转移、分期、分级等临床病理特征均无显著相关性(P>0.05)。直肠癌的p53表达水平显著高于结肠癌(P=0.033),而高、中分化的结直肠癌的CEA表达水平显著高于低、未分化结直肠癌(P=0.020)。5. TSP50鉴别诊断结直肠癌与结直肠正常组织或腺瘤的敏感性为68.4%、特异性为92.5%、阳性预测值为95.6%、阴性预测值为55.2%、约登指数为60.9%。6. TSP50高表达患者的5年生存率为42.8%、中位生存时间为48月(95% CI =30.804-65.196),而低表达患者的5年生存率为73.3%、中位生存时间为108月(95% CI=96.921-119.079)。Kaplan-Meier生存分析发现高表达TSP50的结直肠癌患者预后显著差于低表达TSP50的结直肠癌患者(P=0.010),这种差异尤其表现在早期(TNM I, II期)结直肠癌患者中(P=0.004)。进一步构建多因素Cox模型分析发现,TSP50在结直肠癌患者中是一个独立的预后因素(HR=2.205,95% CI=1.214-4.004,P=0.009)。结论1. TSP50普遍异常高表达于结直肠癌,而在正常结直肠组织中低表达或不表达。结直肠癌组织的TSP50表达水平显著高于癌旁组织。2. TSP50能够以较高的特异性与阳性预测值鉴别诊断结直肠癌与结直肠正常组织或腺瘤,是一个具有潜在应用价值的结直肠癌分子靶标。3. TSP50的高表达在结直肠癌患者中很可能是一个新的、独立的预后不良因素,尤其表现在早期结直肠癌患者中。