目的:用悬浮克隆培养技术,在体外从胚胎大鼠的脊髓组织分离神经干细胞,并进行扩增传代培养,观察其自我复制和多潜能分化特性。 方法: 1 取材 在解剖显微镜下取出胚胎第13天（E13）大鼠的脊髓组织。 2 消化 将取得的脊髓组织用消化液（1.34mg/ml透明质酸酶溶液和0.25%的胰蛋白酶溶液1:1混合+0.2mg/ml的犬尿烯酸）消化。 3 分散和接种 用吸管将组织块吹打分散,记数活细胞数后分别以4×10⁴/ml、4×10⁵/ml和4×10⁶/ml三种密度接种于24孔培养板中,培养孔底部未涂任何底物,细胞在37℃、饱和湿度、5%CO₂条件开放悬浮培养于神经干细胞完全培养液中,用神经干细胞完全培养液进行常规培养。 4 机械传代培养 将原代培养6-7天后形成的含初级神经干细胞球的培养液移入小培养皿中,用细头经火抛光的玻璃吸管轻轻吹打,用机械方法将大细胞球分散成单细胞或分散成较小的细胞球。初级神经干细胞球经传代后形成的次级和再次级神经干细胞球也依此方法传代。 5 神经干细胞的分化培养 5.1 在神经干细胞完全培养液中的分化 将涂有多聚赖氨酸的玻璃盖片放入培养孔,选择只贴有单细胞球的盖玻片放入新的培养孔中,在神经干细胞完全培养液中观察其贴壁后的迁移、增殖和分化。 5.2 血清对贴壁分化的影响 将贴有单细胞克隆的盖玻片放入新培养孔,从神经干细胞完全培养液中撤除EGF和bFGF并添加10%的血清,观察其贴壁后的迁移、增殖和分化。 6 免疫细胞化学方法对神经干细胞及其多分化潜能的鉴定 分别用抗神经干细胞特征性骨架蛋白Nestin的抗体和神经元（MAP₂）、少突胶质细胞（GC）和星