为了研究小球藻硝酸盐的同化机制,该实验首次从椭圆小球藻中克隆了硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因的cDNA,并在转录水平上对硝酸还原酶基因的表达调控进行了研究;同时分离了椭圆小球藻硝酸还原酶基因的上游调控序列,并通过报告基因的方法对该调控区的功能进行了研究.主要结果如下:1.椭圆小球藻硝酸还原酶及亚硝酸还原酶基因的cDNA克隆及特性为了研究椭圆小球藻的硝酸盐同化机制,克隆了椭圆小球藻硝酸还原酶和亚硝酸还原酶基因(以下简称NR和NiR)的cDNA.通过RT-PCR对NR和NiR基因的mRNA丰度定量,发现在没有任何氮盐时,两基因仍有一定的转录.硝酸盐能够诱导两基因的转录,但诱导作用并不是非常的强烈.铵盐则抑制两基因的转录,在仅有铵盐作为唯一氮盐时,NR和NiR基因的转录被强烈抑制.研究发现硝酸盐诱导1小时后,NR和NiR基因的mRNA转录便明显增加,随着硝酸盐诱导时间的增长,增加幅度并不再进一步增大;铵盐处理藻细胞1小时后,NR和NiR基因的转录物便强烈被抑制.从上可以看出小球藻中NR基因的转录调控主要为铵盐抑制解除型的.即只要溶液中没有铵盐,NR基因便能转录.并且研究发现,这两个基因的转录具有相似的调控方式,它们可能协同表达,在小球藻硝酸盐同化时协同作用.2.NR基因启动子的分离及功能研究为研究小球藻NR基因的表达调控方式,通过TAIL-PCR,首次从椭圆小球藻中克隆了NR基因的5上游调控序列,并通过启动子缺失的方法,构建了多个NR基因缺失启动子和β-葡萄糖苷酸(GUS)报告基因融合的表达载体,并通过电击法转入小球藻中.3.椭圆小球藻NR基因启动子在小球藻生物反应器中的应用为了改造现有的小球藻生产兔防御素的生物反应器,通过GUS报告基因的方法,比较了NR基因启动子与现在生物反应器中使用的Ubiquitin启动子在小球藻中的强度,发现NR基因启动子的强度比Ubiquitin启动子的强度高了近4倍.同时用NR基因启动子替代Ubiquitin启动子,构建了新的兔防御素表达载体,转化小球藻,结果发现其表达产物能够完全抑制大肠杆菌的生长,具有正常的生物学活性,表明NR基因启动子能够用于小球藻生产兔防御素的生物反应器中.