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一、未抗病毒治疗的慢性HBV感染者肝内HBV ccc DNA耐药相关位点变异的检测目的证实未抗病毒治疗的慢性HBV感染者肝内HBV ccc DNA存在耐药相关位点的变异,了解肝内HBV变异病毒株与血中的异同。方法①挑选出85例未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者,留取肝穿组织和血清。②用QIAamp? DNA Mini Kit试剂盒和直接煮沸法分别抽提肝穿组织、血清中的HBV相关基因。③以不降解质粒的ATP依赖DNA酶(PSAD)酶切纯化肝穿组织中的HBV DNA。定量酶切前后肝内HBV DNA载量以及血清中HBV DNA载量。④检测血清乙型肝炎病毒血清免疫标志物和血清肝功能生化指标(ALT),分析其与HBV含量之间的关系。⑤应用本实验室设计的两对跨双缺口引物行巢式聚合酶链反应(PCR)扩增HBV ccc DNA、两对非跨双缺口引物行巢式PCR扩增松弛环状DNA(rc DNA)。所有引物扩增的片段涵盖拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦常见已知耐药位点。⑥应用直接测序法对巢式PCR的DNA产物进行测序检测,观察耐药相关变异位点的变异情况。⑦对比分析肝内HBV ccc DNA、HBV rc DNA和血清中HBV DNA的基因序列。结果肝内HBV ccc DNA水平、肝内HBV DNA水平以及血清HBV DNA三者之间的关系呈正相关(P<0.05);肝功能指标ALT水平与HBV DNA载量之间没有相关性(P>0.05);在85例患者中,HBV ccc DNA耐药相关位点变异阳性两例(2.4%):204位点变异一例rtM204I(45号),214位点变异一例(49号)。另有一例测序图谱显示杂峰(85号)。且相应的血清及肝组织HBV DNA中也都发现同样变异。结论在未经抗病毒治疗的慢性HBV感染者肝内HBV ccc DNA中发现耐药相关位点变异,证实HBV ccc DNA存在耐药相关位点自然变异。二、HBV ccc DNA耐药相关位点自然变异病毒株目的基因片段的克隆分析目的了解出现HBV ccc DNA耐药相关位点自然变异的患者体内HBV的变异株与野生株所占比例。方法①以第一部分试验出现变异的标本(血清及酶切前后肝内HBV相关基因)为克隆模板。巢式PCR法同第一部分。②按照克隆试剂盒的具体步骤(纯化、连接、转化等)完成操作。观察克隆结果,每份标本随机挑取50个单克隆菌落,直接测序。③对测序结果进行比对分析,了解每份标本的变异株与野生株的比例。结果①204位点克隆分析:肝内HBV ccc DNA ATG/ATT/ATC=10/38/2、肝内HBV rc DNA ATG/ATT/ATC=3/45/2、血清HBV DNA ATG/ATT/ATC=0/50/0;②214位点克隆分析:肝内HBV ccc DNA GTA/GCT/GTT=20/29/1、肝内HBV rc DNA GTA/GCT =5/45、血清HBV DNA GTA/GCT=10/40;③85号杂峰标本克隆分析结果显示大部分耐药相关位点变异是无义突变,仅在肝内HBV ccc DNA目的基因片段的50例克隆中发现1例181位点GCT变为ACT(rtA181T),在血清HBV DNA目的基因片段的50例克隆中发现1例250位点ATG变为GTG(rtM250V)。结论肝内ccc DNA耐药相关位点发生自然变异的患者体内病毒株为变异株与野生株混合存在,肝内HBV ccc DNA、rc DNA及血清HBV DNA的变异株和野生株比例不一致。85号标本的克隆分析提示此HBV病毒株存在较多无义突变,但不影响HBV基因表达。