论文部分内容阅读
禽腺病毒(FAV)归为腺病毒科禽腺病毒属,根据抗原性差异,分为3个群。I群禽腺病毒(FAVI)具有共同的群抗原,共12个血清型(FAV1-FAV12),在鸡、鸭、鹅体内普遍存在,呈隐性感染,与其他病原共同作用于家禽。2008-2010年从广西南宁市活禽市场采集259份样品,通过SPF鸡胚传代增殖与PCR鉴定,分离到92份FAV,阳性率为35.5%(92/259)。选取不同年份的8株,进行血凝性、免疫琼脂扩散、形态学、致细胞病变和鸡胚致病性试验。结果显示,8株均不凝集鸡红细胞,能与FAVI阳性血清反应,具有腺病毒粒子的典型特征,致细胞变圆、折光性增强,使鸡胚发育不良。克降8株hexon基因,经序列分析,均与FAVI同源性最高。经遗传进化分析,均与FAVI亲缘关系最近,结果表明,8株分离株为FAVI。根据GenBank中FAVI hexon、penton、100K、33K基因序列,设计引物,经PCR扩增,与pGEX-4T-1载体连接,转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经IPTG诱导,表明四种重组蛋白得到良好表达；经可溶性分析,表明hexon、penton表达产物以包涵体的形式存在,100K、33K表达产物以可溶性的形式存在；经纯化,表明四种重组蛋白达到了较高的纯度和浓度；经western-blot检测,具有良好的反应原性,可作为间接ELISA的诊断抗原。以hexon和penton结构蛋白分别作为包被抗原,建立检测FAVI抗体的间接hexon-ELISA和penton-ELISA力法。结果农明,抗原最适包被浓度分别为1O.Oug/mL和15.0ug/mL；一抗血清和最适稀释度均为1：100；酶标二抗最适稀释度均为1：2000；一抗和二抗最适作用时间均分别为75min和45min。两种ELISA方法具有良好的特异性、敏感性、重复性。以不同比例的hexon、penton两种蛋白混合包被,建立hexon-penton-ELISA方法。用三种ELISA方法检测野毒感染和灭活苗免疫血清各30份,结果表明两种血清均有反应,hexon-penton-ELISA灵敏度更高。用三种ELISA方法检测临床样品100份,阳性率分别为45%、41%、48%。为FAVI抗体的检测和流行病学调查提供简便、快速的血清学诊断方法。以100K和33K非结构蛋白分别作为包被抗原,建立检测FAVI抗体的间接100K-ELISA和33K-ELISA方法。结果表明,抗原最适包被浓度分别为10.8u∥mL和12.0u∥mL；一抗血清最适稀释度均为1：100；酶标二抗最适稀释度均为1：3000；一抗和二抗最适作用时间均分别为60min和45min。两种方法具有良好的特异性、敏感性、重复性。以不同比例的100K、33K两种蛋白混合包被,建立间接100K-33K-ELISA方法。J1j三种ELISA方法检测野毒感染和灭活苘免疫_I『n.消符30份,表明100K-33K-ELISA灵敏度更高。用三种ELISA方法检测临床样l ul 100份,15I…j率分别为40%、35%、42%。该方法可检出FAVI野毒感染血消,而与火活苘免疫血消无反应,为该病的诊断与净化提供技术支撑。