背景脑血管病是导致人类死亡的三大疾病之一,我国脑血管疾病的发病与死亡情况均处于世界较高水平。因此,对缺血性脑血管病的研究是医学领域的重要研究课题之一。中药三七具有活血化瘀通络的功效,广泛应用于缺血性脑血管疾病的治疗。药理研究显示,三七总皂苷(total saponins of panax notoginseseng, PNS)是中药三七的主要有效成分,能够有效减轻缺血性脑损伤,尤其对血管内皮的保护、修复和再生作用明显。前期利用基因芯片技术对PNS干预拟缺血损伤脑微血管内皮细胞的作用靶点的筛选中发现,PNS能够上调拟缺血损伤内皮细胞TGF-β、SMAD5. ID1mRNA水平,提示TGF-β-SMAD5/ID1信号通路可能是其发挥保护内皮细胞的主要靶点之一。因此,本研究利用原代培养的脑微血管内皮细胞,通过氧糖剥夺制备拟缺血损伤模型,从TGF-β-SMAD5/ID1信号通路角度研究三七总皂苷保护内皮细胞、抗细胞凋亡的分子机制,为其临床应用提供实验依据。目的观察三七总皂苷对拟缺血脑微血管内皮细胞凋亡、TGF-β-SMAD5/IDI信号通路相关因子及其下游TSP-1、VEGF-B表达影响,以期从分子层面阐述三七总皂苷的发挥内皮保护作用的内在机制和作用靶点。方法1、采用原代取材方法获得大鼠脑微血管内皮细胞(Microvascular endothelial cell, MVEC),进行培养、纯化和传代。采用氧糖剥夺(oxygen-glucose-deprivation, OGD)的方法制备拟缺血损伤细胞模型。2、细胞的分组与处理：将培养至3代的脑微血管内皮细胞随机分为4组：正常组、模型组、三七总皂苷组、三七总皂苷+阻断剂组。除正常组外,其余各组采用OGD法造模,三七总皂苷组在造模前及过程中加入终浓度为22μg/ml的三七总皂苷；三七总皂苷+阻断剂组：在加入三七总皂苷的同时使用1.8nnM阻断剂K02288(一种高度选择性Ⅰ型BMP受体抑制剂)。3、采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,观察三七总皂苷对拟缺血内皮细胞凋亡的干预作用。4、采用ELISA法检测各组细胞上清液中TGF-β含量,采用Real-Time PCR、Westernblot等方法检测各组细胞ALK1、SMAD5、ID1mRNA及蛋白的表达,观察三七总皂苷对拟缺血内皮细胞TGF-β-SMAD5/ID1信号通路的调节作用。5、采用ELISA法检测各组细胞上清液中TSP-1、VEGF-B的表达,观察三七总皂苷对TGF-β-SMAD5/ID1通路下游两种蛋白表达的影响,以揭示三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞发挥抗凋亡作用的分子机制。结果1、三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞凋亡的影响与正常组比,模型组细胞凋亡率显著性升高,差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,三七总皂苷组、三七总皂苷+阻断剂组细胞凋亡率明显下降(P<0.01)。2、三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞TGF-β/Smads/iD1通路相关分子表达的影响与正常组相比,模型组细胞上清液中TGF-β1含量明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比,三七总皂苷组细胞上清液中TGF-β1含量无明显变化。与正常组相比,模型组细胞ALK1、Smad5及Idl表达显著性增强(P<0.05,P<0.01)；与模型组相比,三七总皂昔组细胞Smad5 mRNA表达显著性增强(P<0.01),ALK1、Smad5蛋白、Id1mRNA表达表达有增强的趋势,但差异没有统计学意义(P>0.05)。3、三七总皂苷对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞TSP-1、VEGF表达的影响与正常组相比,模型组细胞上清液中TSP-1含量明显升高(P<0.01)；与模型组相比,三七总皂苷组TSP-1含量显著性降低(P<0.01)；三七总皂苷+阻断剂组TSP-1含量有降低趋势,两组比较,三七总皂苷的下调作用明显(P<0.01)。与正常组相比,模型组细胞上清液中VEGF-B含量显著性增多,差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比,三七总皂苷组VEGF-B含量明显增多(P<0.05)；三七总皂苷+阻断剂组和三七总皂苷组相比,细胞上清液中VEGF-B含量无显著性差异(P>0.05)。结论1、拟缺血损伤后脑微血管内皮细胞凋亡明显增加,三七总皂苷可明显降低拟缺血内皮细胞的凋亡,显示出内皮保护作用。2、拟缺血损伤后,内皮细胞ALK1、Smad5及Idl表达增加,提示缺血性损伤后TGF-β/Smad5/Id1信号通路激活,三七总皂苷可进一步上调该信号通路相关分子的表达。3、三七总皂苷可减少拟缺血内皮细胞TSP-1的含量,增加VEGF-B的含量,BMP受体阻断剂K02288可在一定程度上阻断上述效应,提示三七总皂苷通过调节TGF-β/Smads/ID1通路而影响TSP-1、VEGF-B表达,这可能是三七总皂苷抗凋亡作用的内在机制之一。